Pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法

本发明属于微生物检测，尤其涉及一种pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法。

背景技术：

1、目前，果胶杆菌属(pectobacterium spp.)是一种植物坏死性细菌病原体，可导致极具破坏性的植物病害，包括常见的软腐病、黑腿病、枯萎病和气腐病(czajkowski etal.,2011；davidsson et al.,2013)。该属的菌株可在全球范围内造成大田作物、各种蔬菜、水果和观赏植物的严重损失(toth et al.,2003；ma et al.,2007)。由于其在农业生产和储运过程中的破坏性影响，果胶杆菌被认为是十大最危险的植物致病菌之一(mansfieldet al.,2012)。据报道，果胶杆菌属主要包括10个种，分别为：p.carotovorum，p.wasabiae，p.betavasculorum，p.cacticida，p.aroidearum，p.peruviense，p.atrosepticum，p.parmentieri，p.polaris和candidatus p.maceratum。其中，p.carotovorum、p.atrosepticum和p.parmentiteri是造成经济损失最严重的3种软腐病种(davidsson etal.,2013；khayi et al.,2016)。与p.atrosepticum和p.parmentiteri相比，p.carotovorum的寄主范围更广且异质性更强，可进一步分为3个有效亚种：p.carotovorumsubsp.brasiliense(pcb),p.carotovorum subsp.carotovorum(pcc),p.carotovorumsubsp.odoriferum(pco)，以及1个新提出但尚未有效发表的：果胶裂解酶、果胶甲基酯酶和果胶聚半乳糖醛酸酶(samaneh et al.,2016；chuang et al.,1999)，它们能分解并利用细胞壁和中间薄层的果胶质，导致细胞瓦解、组织崩溃及细胞质亚种：p.carotovorumsubsp.actinidiae(pca)(czajkowski et al.,2015；nabhan et al.,2012；koh et al.,2012；li et al.,2018)。

2、果胶杆菌属具有大量致病性决定因素，有助于抑制植物的防御机制，从而发挥其特有的症状。果胶杆菌属在植物中已知毒力因子主要包括：分泌系统、蛋白酶、植物细胞壁降解酶(pcwde)、效应分子、鞭毛运动、铁获取系统、多糖、细胞附着蛋白、植物毒素、3-羟基-2-丁酮途径(3h2b)和其他由单个基因编码的毒力元件等(arizala and arif,2019)。p.carotovorum主要致病性决定因素是一系列胞外果胶酶，包括几种果胶裂解酶同工酶渗漏。此外，p.carotovorum subsp.carotovorum(pcc)亚种的iii型分泌系统也产生一种或多种抗菌物质，称为细菌素，这增强了它们与其他相关竞争物种的竞争力(yasunaka andamako,1979；chan et al.,2009；he et al.,2021)。近年来，多种十字花科蔬菜(番茄、辣椒、黄瓜、茄子、胡萝卜、生菜、洋葱和大白菜)以及其他茄科寄主(土豆、烟草)上均报道了由p.carotovorum subsp.carotovorum(pcc)侵染引起的软腐病；同时，其也是魔芋软腐病的主要致病菌(abd-el-khair et al.,2021；huang et al.,2019；lee et al.,2013)。

3、在与植物的接触中，植物病原物为了自身的利益，进化出复杂的入侵策略，绕过防御系统，有效地侵染寄主。作为目标物，为了保持健康，植物已经发展出强大的武器来抵御病原物，包括多层物理屏障、预先形成的防御和先天免疫系统(zhang et al.,2020)。近年来的研究表明，某些病原菌可以通过另一条监测系统来阻断，这条监测系统是一个新兴的防御屏障——植物微生物组(hacquard et al.,2017；gong and xin,2021；li et al.,2021)。

4、植物微生物组包含多种微生物群落，其中一些进入植物组织，称为内生微生物群落；而另一些停留在植物组织的外表面，称为附生微生物群落；还有一部分生活在根系临近的土壤，以来自根系的分泌物、外渗物和脱落细胞而生长，称为根际微生物群落(compantet al.,2019；schlaeppi and bulgarelli,2015)。植物微生物组的组装是由扩散、物种相互作用、环境和宿主决定的一个连续的多步骤过程，首先，植物以根际沉积物的形式释放信号分子(即酚类、蛋白质等)吸引微生物群落(步骤1)；其次，微生物对植物导向的信号分子进行响应，启动动员并以附生植物和内生植物的形式定植于植物的各个部分(步骤2)。植物微生物组主要通过水平途径(即从邻近环境获得)和垂直途径(即直接从亲本获得)传播，植物微生物群的最终多样性是由植物和微生物之间错综复杂的信号传递所组成的一系列阶段形成的(noman et al.,2021)。

5、在这个复杂的组装过程中，微生物群落与植物相互作用，在促进植物的生长和健康方面发挥重要作用(trivedi et al.2020)。一方面通过固氮、溶磷、解钾和产植物激素等直接作用来提高植物对土壤养分的吸收进而调节植物生长(backer et al.,2018；goudaet al.,2018；trivedi et al.,2020)；另一方面，植物微生物通过产生抗生素、裂解酶、挥发物和铁载体来保护植物免受病原体的侵害。各种微生物结构(例如分泌系统、鞭毛和菌毛)以及蛋白质(例如效应蛋白)通过触发诱导的系统抗性而间接促进植物防御(trivediet al.2020)。此外，植物微生物还参与调节植物的次生活性物质的产生，例如炭疽菌产生的青蒿素和紫衫菌产生的紫衫醇(et al.,2013；huang et al.,2018)。因此，植物微生物组被称为植物的“第二基因组”，近年来收到越来越多的关注，并被广泛应用于植物响应各种环境胁迫和植物-病原互作研究中(李艳梅,2022)。

6、随着生物学技术的发展，微生物组学的研究方法也经历不同的发展阶段，首先是传统微生物分离培养技术，其主要对获得菌株进行生理生化的研究；接着是dna指纹图谱、biolog技术、磷脂脂肪酸法和基因芯片等分子生物学技术，其打破传统分离方法而实现对环境微生物群落的直接分析(高贵锋褚海燕,2020)；最后是高通量测序和质谱技术及生物信息学，其直接推动微生物组学的快速发展(bahram et al.,2018；kleiner et al.,2018)。目前，植物微生物组学的研究最广泛应用的是多组学技术手段，包括高通量测序技术、宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白组学和宏代谢组学(高贵锋褚海燕,2020)。此外，可培养和免培养技术的联合应用为探索植物微生物组的功能提供新的研究思路，为全面系统及多方位诠释植物微生物组及其与宿主相互作用的关系提供了技术支撑(李艳梅,2022)。

7、微生物在植物-病原物互作中的作用，植物微生物组的成员包括中性微生物、病原微生物和有益微生物。植物在其生命过程中不仅要与微生物群落建立有益的联系，而且还要应对各种病原微生物的侵染。病原微生物通过与有益微生物群相互作用，即争夺养分和空间，产生抗菌化合物，从而对植物健康产生负面影响。此外，病原菌还通过传递效应蛋白来阻止根际群落中有益微生物的活动，从而促进其他对植物有害的微生物的定殖(nomanet al.,2021；gao et al.,2021；snelders et al.,2018)。植物及其相关的微生物群在数百万年的时间里共同进化，一些与宿主相关的有益微生物群落参与植物的疾病抑制和营养动员(pieterse et al.,2014；backer et al.,2018)。长期以来，人们一直在研究植物微生物在保护寄主免受植物病原影响方面的作用，通常，有益微生物通过直接(通过与病原体相互作用)或间接(通过激活寄主植物的先天免疫反应)作用保护植物免受病原体的攻击。解读这些关键类群(如生物标志类群、核心类群和网络中心)及其与寄主植物和病原体的相关性，对于利用植物微生物群促进植物生长和健康至关重要(li et al.,2021；noman etal.,2021)。

8、在直接抑制植物病原菌中的作用，一些研究证实了土传病害的发生与土壤微生物群落密切相关，健康土壤微生物多样性较高，土壤微生物多样性与植物对病原菌的抗性呈正相关。健康土壤中的有益微生物：芽孢杆菌属(bacillus)、链霉菌属(streptomyces)、农霉菌属(agromyces)、小单孢菌属(micromonospora)、假单胞菌属(pseudonocardia)、枝顶孢菌属(acremonium)、溶杆菌属(lysobacter)、慢生根瘤菌(bradyrhizobium)、毛壳菌属(chaetomium)等的相对丰度较高，可改善土壤养分、促进植物生长和控制土传病害(wanget al.,2017)。在土壤的所有抑病机制中，抗生素(即一个有机体产生抗菌代谢物以抑制另一个有机体的生长和增殖)是研究最广泛的(gómez expósito et al.,2017)。许多土壤微生物都有产生抗生素的能力，链霉菌属以其产生抗生素的强大能力而闻名于世，从抑制病的土壤中分离出的链霉菌菌株可以产生具有抗真菌活性的不同voc(cordovez et al.,2015)，从草莓田的抑病土壤中分离出来的几个链霉菌物种能在尖孢镰刀菌中产生靶向真菌细胞壁生物合成的抗真菌硫肽(cha et al.,2016)；枯草芽孢杆菌能产生超过24种的抗菌物质，能抑制多种病原菌或诱导植物系统抗性。从玉米、水稻、小麦和大蒜根际土中分离到的许多芽孢杆菌和链霉菌对禾谷孢镰刀菌、拟茎点霉菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢菌和小麦纹枯菌等表现出较强的抑菌活性(villa-rodríguez et al.,2019；张敏，2021)。一些芽孢杆菌还被证明对青枯菌(ralstonia solanacearum)引起的青枯病有效(bahmani et al.,2021；ahmed et al.,2022a)，解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens,bz6-1)被发现通过产生丰霉素a和表面活性素可以降低花生的青枯病发生率(wang and liang,2014)；在另一项研究中，从山区土壤中分离出的b.velezensis(fjat46737)能分泌脂肽显著抑制了番茄青枯病的发生率达96.2％(chen et al.,2020)。除链霉菌和芽孢杆菌外，假单胞菌属也可以通过竞争和抗生素来抑制植物病原菌的生长，几种假单胞菌在土壤中产生的抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(dapg)和吩嗪(phz)已被证实对亚麻和小麦枯萎病有抑制作用(mazurier et al.,2009)。此外，一些其他土壤微生物也被证明与植物病害抑制相关，农霉菌、小单孢菌和假单胞菌通过产生木聚糖酶对木聚糖的降解起重要作用(rivas et al.,2004)；枝顶孢菌和毛壳菌通过产生裂解酶和抗微生物代谢物来防治植物病害；小单孢菌、枝顶孢菌和溶杆菌也可以产生抗菌化合物来保护植物免受病原体的侵染(donald et al.,2005；ismet et al.,2004)。

9、如果一种病原体成功地穿越了根际微生物，即所谓的抵御病原体入侵的第一道防线，进入植物体内，内生菌就会起作用，为植物提供另外的保护。当病原体进入时，内生菌开始招募微生物群落，微生物群落启动它们的遗传机制，产生防御酶和代谢物来对抗病原体(uroz et al.,2009)。水稻种子内生菌—瓜类鞘氨醇单胞菌(sphingomonas melonis)通过产生邻氨基苯甲酸促进水稻幼苗对水稻穗腐病菌(burkholderia plantarii)的抑制(matsumoto et al.,2021)。立枯丝核菌侵染甜菜时，几种内生细菌通过激活生物合成基因簇引起疾病抑制，这些微生物产生抗真菌效应物，包括可以消化真菌细胞壁的酶，以及次级代谢物，包括吩嗪类、聚酮酸和铁载体，它们可能有助于甜菜抗真菌侵染(carrión et al.,2019)。宏基因组分析表明，与健康植物相比，患病植物中参与解毒、趋化和生物膜形成的微生物组功能基因丰富，如udp-葡萄糖醛酸转移酶在病辣椒茎表皮的微生物组中富集(gaoet al.,2021)。udp葡糖醛酸基转移酶编码一个解毒酶家族(tephly and burchell,1990；rowland et al.,2013)，可对由镰刀菌属(fusarium spp.)或其他病原真菌共同感染产生的有毒代谢产物，如镰刀菌酸、单端孢霉烯族毒素、串珠镰孢菌毒素和恩镰孢菌素进行解毒(roncero et al.,2003；escriva et al.,2015)。csgd、luxr家族转录调控因子是生物膜形成过程中的主要调控因子，研究发现这些调控因子在病根内生微生物群中富集，它可以保护微生物免受不利环境条件的影响，从而提高微生物的生存能力(sharma et al.,2016；danhorn and fuqua,2007；hassani et al.,2018)。同时，还有研究发现病根内生微生物群中富集了多个与植物-微生物群信号通路相关的编码mcps的基因。mcps是运动性细菌中主要的化学受体，在检测到特定化学物质时，它会改变chea组氨酸激酶的活性和细菌的游动行为(salah ud-din and roujeinikova.,2017)，mcps已在典型的有益细菌中被鉴定，例如枯草芽孢杆菌(garrity and ordal.,1995)和假单胞菌(sampedro et al.,2015)。根内生菌印度梨形孢(serendipita indica)基因组含有萜类合成酶基因(sitps)，当侵染番茄根部时，sitps基因显著上调表达，在大肠杆菌中异源表达sitps能检测到具有抑菌活性的倍半萜物质，推断印度梨形孢能诱导倍半萜物质的合成从而阻止病原菌的侵染(ntana etal.,2021)。此外，具有潜在挥发性有机化合物生产潜力的微生物也被认为是抵御病原物的关键组分(gómez et al.,2017)。sanchis-lópez等(2021)从番茄不同组织中分离出多种不同属内生菌能够合成挥发性物质，这些物质能够有效抑制番茄的赤星病菌、链格孢霉和棒孢霉3种病原真菌的生长。

10、在植物免疫应答激活中的作用，新的证据表明，植物相关微生物群落还可以通过调节植物的防御机制帮助寄主植物获得对病原菌的抗性(finkel et al.,2017)。内生菌能够激发植物免疫系统中的诱导系统抗性(isr)(kloepper and ryu,2006；pieterse etal.,2009)，而接种促生菌的寄主植物能够更高效快速的响应病原菌侵染启动防御反应，提高植物的保护能力(张敏,2021)。微生物引发的免疫反应使植物对病原体的攻击具有弹性，大大提高了抗病效率(chen et al.,2018)。研究发现，荧光假单胞菌株wcs365、wcs417r能够诱导植物产生广谱抗病性(张敏，2021)。棉花及番茄幼苗中的内生菌球孢白僵菌(beauveria bassian)能够通过竞争或者诱导植物系统性抗性的方式使寄主植物产生对立枯丝核菌的抑菌作用，从而增强了植物对猝倒病的抗性(ownley et al.,2008)。无色杆菌属(achromobacter)、丛毛单胞菌属(comamonas)、短小杆菌属(curtobacterium)、肠杆菌属(enterobacter)、勒克氏菌属(leclercia)、微杆菌属(microbacterium)、泛菌属(pantoea)、鞘氨醇杆菌属(sphingobacterium)和寡养单胞菌属(stenotrophomonas)的物种的拮抗剂对稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)表现出巨大的生防潜力，并能诱导水稻幼苗抗稻瘟病防御基因oscebip，oscerk1，oseds1和ospad4的表达(sahu et al.,2020)。类似地，根相关假单胞菌(pseudomonas sp.,ea105)和泛菌(pantoea sp.,ea106)通过引发茉莉酸和乙烯诱导的系统抗性(isr)反应抑制水稻稻瘟病的发生(spence et al.,2014)。cha等(2016)和kesten等(2019)的研究发现病原菌攻击会引起寄主植物根系渗出模式的改变，从而导致特异性抗性诱导微生物群的定殖，通过调节水杨酸生物合成途径，诱导细胞壁强化，可激活番茄植株抗尖孢镰刀菌(f.oxysporum)攻击的防御机制。

11、目前，微生物组学和代谢组学联合分析已被广泛应用于医学领域，例如肠道微生物组和人体代谢组的多组学研究，为人类健康和疾病提供了新的认识。最近的一些肠道微生物组和粪便代谢组的关联分析的研究揭示了辣木多糖干预可降低炎性细胞因子的表达，促进小鼠体内lachnospiraceae_nk4a136、intestinimonas和双歧杆菌(bifidobacterium)等益生菌的生长以及调节多不饱和脂肪酸的代谢从而预防溃疡性结肠炎(tian et al.,2022)；此外，还有研究发现日粮中添加大麦叶可导致微生物来源的嘌呤代谢产物肌苷的富集，肌苷可激活人结肠上皮细胞的(ppar)γ信号转导而减轻结肠炎(li et al.,2021)。另外的一项研究发现肠道微生物的改变及相关代谢输出的改变可能与阿尔茨海默症的发病有关，提示粪便标志物可作为辅助ad筛查和诊断的无创检查手段(xi et al.,2021)。

12、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术缺乏软腐病对魔芋相关微生物群落的影响的测定。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法。

2、本发明是这样实现的，一种pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，所述pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法，包括以下步骤：

3、第一步，魔芋组织内生微生物dna提取、pcr扩增和测序；

4、第二步，魔芋土壤微生物dna提取、pcr扩增和测序；

5、第三步，下机数据的质控与分析，原始测序序列使用trimmomatic软件质控，用flash软件进行序列拼接；线性判别分析lda结合效应大小测量lefse分析用于使用lefse软件搜索不同处理之间的统计学上不同的生物标志物，使用picrust软件对各样本内生细菌群体进行功能预测。

6、进一步，所述第一步，具体包括：参照spin kit for soildna提取试剂盒的步骤对魔芋组织样本的总dna进行提取，dna浓度和纯度利用nanodrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna提取质量。

7、进一步，采用通用引物ts1 f(5’-acttggtcatttagaggaagtaa-3’)和its2 r(5’-bgctgcgttcttcatcgatgc-3’)对魔芋各组织的内生真菌多样性进行分析；pcr扩增采用protaq,20μl反应体系：10μl 2*pro taq；0.8μl forward primer(5μm)；0.8μl reverseprimer(5μm)；10ng template dna；最后加ddh2o至20μl。扩增程序为：95℃预变性3min，35个循环(95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸45s)，最后72℃延伸10min。

8、进一步，在分析内生细菌群落时，共进行两步pcr扩增：16s rrna基因的第一次pcr扩增采用细菌引物799f(5'-aacmggattagataccckg-3')和1392r(5'-acgggcggtgtgtrc-3')进行；扩增体系transgen ap221-02：transstart fastpfu dna polymerase，20μl反应体系：4μl 5*fastpfu buffer；2μl 2.5mm dntps；0.8μl forward primer(5μm)；0.8μlreverse primer(5μm)；0.4μl fastpfu polymerase；0.2μl bsa；10ng template dna；最后加ddh2o至20μl。扩增程序为：95℃预变性3min，27个循环，95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸45s，最后72℃延伸10min；第二次pcr扩增采用的引物是799f(5'-aacmggattagataccckg-3')和1193r(5'-acgtcatccccaccttcc-3')(yang et al,2022)，pcr步骤的所有条件和第一次相同，只是热循环仅进行了13个循环；使用2％琼脂糖凝胶回收pcr产物，并根据制造商的说明使用axyprep dna gel extraction kit试剂盒进一步纯化后，送上海美吉生物医药科技有限公司在illumina miseq pe300平台进行测序。

9、进一步，所述第二步，具体包括：参照spin kit for soil土壤基因组dna提取试剂盒的步骤提取各土壤样品dna，dna浓度和纯度利用nanodrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna提取质量。

10、进一步，细菌用通用引物338f(5'-actcctacgggaggcagcag-3')和806r(5'-ggactachvgggtwtctaat-3')(wang et al.,2017)扩增16s rrna基因的v3-v4区进行多样性分析；用通用引物ts1 f(5’-acttggtcatttagaggaagtaa-3’)和its2 r(5’-bgctgcgttcttcatcgatgc-3’)(zheng et al.,2022)对真菌多样性进行分析。

11、进一步，扩增体系为20μl：4μl 5*fastpfu缓冲液；2μl 2.5mmol·l-1dntps；0.8μlforward primer(5μmol·l-1)；0.8μl reverse primer(5μmol·l-1)；0.4μl fastpfu聚合酶；0.2μl bsa；10ng dna模板；加ddh2o至20μl；扩增程序为：95℃预变性3min，27个细菌和36个真菌循环，95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

12、进一步，所述第三步，下机数据的质控与分析具体包括：

13、原始测序序列使用trimmomatic软件质控，用flash软件进行序列拼接；通过usearch软件过滤得到的序列，并去除嵌合体序列得到有效序列；用uparse软件在97％的相似性水平上划分操作分类单元；代表序列用rdp classifier软件和silva数据库进行物种注释，利用mothur软件作稀释度曲线，计算文库覆盖率coverage，shannon、simpson、ace及chao1指数，对物种的多样性和丰富度指数进行评价，利用qiime软件建立的bray-curtis距离算法进行主坐标分析pcoa；circos图是使用circos-0.67-7软件构建的；线性判别分析lda结合效应大小测量lefse分析用于使用lefse软件搜索不同处理之间的统计学上不同的生物标志物；使用picrust软件对各样本内生细菌群体进行功能预测。

14、进一步，所述pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法的魔芋内生微生物和根际土壤微生物的分离验证，包括：

15、(1)内生微生物的分离和纯化，将来自不同pcc侵染阶段的魔芋组织样品进行表面消毒以去除表面微生物，先用75％乙醇冲洗所有样品2min，再用naclo表面消毒1min，最后用无菌水冲洗10次以去除消毒剂残留物；用于表面消毒的naclo浓度取决于植物组织，0.1％用于叶片，0.3％用于叶柄，0.5％用于根，将最后一次清洗液10μl接种在pda固体培养基上，置于28℃培养箱培养2-3d检查是否有菌落长出；去除表面微生物后用无菌滤纸吸干表面水分，然后用无菌解剖刀将组织切成0.5cm×0.5cm的小块，放置在事先准备好的孟加拉红和na固体培养基上，每皿放3～5块，然后置于28℃恒温培养箱中暗培养；每天观察培养皿上是否有不同的菌落产生，待长出菌落后将其挑到新的孟加拉红和na培养基上进行纯化；

16、(2)可培养土壤微生物的分离和纯化，采用稀释涂布平板法分离来自不同pcc侵染阶段两种魔芋根际土壤中的可培养细菌和真菌群落；具体方法如下：称取10g土壤样品加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中，放在摇床上振荡30min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬浮液；按10倍稀释法稀释到10-2、10-3、10-4，分别吸取100μl悬浮液均匀的涂布于孟加拉红和na固体培养基上，每个处理重复3次；细菌于28℃恒温培养2～3d，真菌于28℃恒温培养3～5d，当培养基上长出明显菌落时，挑取形态不同的菌落进行纯化培养。

17、进一步，所述pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测方法的内生和土壤微生物中pcc拮抗菌的筛选和评价，包括：

18、(1)拮抗细菌群落的筛选和评价，活化菌株和菌液制备，将从不同处理魔芋组织以及根际土壤中分离得到的供试细菌和软腐病病原菌pcc分别接种于lb液体培养基中摇培48h，然后用无菌蒸馏水稀释至细胞浓度为1×108cfu/ml，备用；

19、拮抗细菌筛选及拮抗能力评价取200μlpcc菌液均匀涂布于na固体培养基上，将25μl供试细菌菌液接种于平板中央，同时接种无菌水作为对照，每个处理重复三次，接种后于28℃恒温培养培养24h后采用十字交叉法测量抑菌圈直径与菌落直径，计算相对抑制比值及抑菌谱带大小；

20、相对抑制比值＝抑菌圈直径/菌落直径；

21、(2)拮抗真菌群落的筛选和评价，活化菌株和菌饼制备，将从不同处理魔芋组织以及根际土壤中分离得到的供试真菌接种于pda培养基上活化2～3天后，得到无污染的菌落；将活化好的真菌用挑针挑取少量菌体置于pda培养基上，28℃恒温倒置培养7～8d，然后用打孔器打成直径7mm菌饼，备用；

22、拮抗真菌筛选及拮抗能力评价取200μlpcc菌液均匀涂布于pda固体培养基上，将制备好的7mm供试真菌菌饼正面向下放置于pda平板中，每皿放置3个菌饼，接种后置于28℃恒温培养24h～48h后采用十字交叉法测量抑菌圈直径与菌落直径，计算相对抑制比值及抑菌谱带大小。

23、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

24、第一、本发明利用illumina seq高通量测序技术对pcc胁迫下两种魔芋叶柄、根以及根际土壤相关微生物群落变化进行了评价。1)叶柄组织内，细菌群落共生网络分析显示果胶杆菌属(pectobacterium)与鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)和微杆菌属(microbacterium)均呈显著负相关；pcc胁迫下，两种魔芋的sphingomonas和microbacterium的相对丰度均较对照呈降低趋势，但a.muelleri中二者相对丰度在侵染前和侵染后均高于a.konjac；a.konjac侵染前二者的相对丰度分别为14.24％、0.52％，侵染48h和96h时相对丰度均降为0；a.muelleri侵染前的相对丰度分别为63.30％、4.26％，侵染48h时为0.11％、0.01％，侵染96h时为0.75％、0.05％。关于真菌群落，枝孢菌属(cladosporium)相对丰度在两种魔芋受侵染后均较对照呈增加趋势，但a.konjac侵染前和侵染后的相对丰度均低于a.muelleri。2)根组织内，a.konjac侵染前、侵染48h和侵染96h的黄杆菌属(flavobacterium)相对丰度分别为3.33％、37.71％和8.18％，a.muelleri分别为1.73％、1.42％和4.72％，a.konjac的相对丰度表现为侵染前和侵染后均高于a.muelleri。真菌群落中，双核丝核菌属(ceratobasidium)相对丰度在a.konjac受侵染后呈持续降低趋势，相反，在a.muelleri受侵染后呈持续增加趋势。3)根际土壤中，高山被孢霉(m.alpina)、青霉菌属(penicillium)、芽孢杆菌属(bacillus)和溶杆菌属(lysobacter)等有益微生物相对丰度在a.konjac受侵染过程中呈降低趋势；相反的，在a.muelleri受侵染过程中呈增加趋势。内生微生物和根际微生物的分离验证结果显示，内生微生物中的枝孢菌属菌株以及土壤微生物群落中的高山被孢霉均对pcc表现出良好的拮抗作用，平均抑菌谱带分别为1.08cm和1.12cm。

25、第二，在本发明中，魔芋内生微生物群落中鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)、微杆菌属(microbacterium)、枝孢菌属(cladosporium)、双核丝核菌属(ceratobasidium)等，土壤微生物群落中高山被孢霉(m.alpina)、青霉菌属(penicillium)等相对丰度动态变化参与了两种魔芋对pcc侵染的响应，抗感魔芋之间微生物群落对pcc侵染的响应差异主要表现在优势物种的相对丰度变化趋势和相对丰度含量不同。内生微生物和根际微生物的分离验证结果显示，内生微生物中的枝孢菌属菌株以及土壤微生物群落中的高山被孢霉均对pcc表现出良好的拮抗作用，平均抑菌谱带分别为1.08cm和1.12cm。表明，魔芋相关微生物群落(内生微生物、根际微生物)动态的变化和组装参与了对pcc胁迫的响应，a.muelleri倾向于招募更多的有益微生物来参与pcc胁迫的应答。

26、第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

27、(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

28、本发明对pcc胁迫下两种魔芋(根组织、叶柄组织、叶片、根际土和非根际)相关微生物群落的变化进行深入评价，并分离鉴定了魔芋内生及根际土壤中的pcc拮抗菌枝孢菌属(cladosporium)和高山被孢霉(m.alpina)等菌株，为枝孢菌、高山被孢霉等生防微生物菌剂开发利用，以及魔芋相关微生物群落调控或根际微生态调控等软腐病防治方法的应用奠定基础。

29、(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：

30、植物微生物组学的研究应用最广泛的是多组学技术手段，包括高通量测序技术、宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白组学和宏代谢组学。本发明提出了一种pcc胁迫下魔芋及根际土壤微生物群落变化检测的新方法。根据我们提出的方法，将16s rrna和18s rrna高通量测序分析与传统的可培养微生物分离方法相结合，可培养和免培养技术的联合应用为探索pcc胁迫下魔芋微生物组的功能提供新的研究思路，同时为全面系统及多方位诠释魔芋微生物组及其与宿主相互作用的关系提供了技术支撑。