一种富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片的制备及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片的制备及其应用。

背景技术：

1、线粒体是负责维持能量代谢、产生细胞所需的三磷酸腺苷（atp）等重要功能的细胞器。研究表明，线粒体功能障碍与多种疾病的发生和发展密切相关，如线粒体脑肌病、神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病）、心血管疾病、肿瘤和代谢性疾病等。线粒体功能障碍在这些疾病的发病机制中起着重要作用，如线粒体呼吸链功能障碍和活性氧生成增加可导致氧化应激，进而对机体细胞、组织和器官产生损害，导致疾病的发生发展。

2、线粒体在创面愈合过程中也发挥着不可或缺的作用。近期研究表明，细胞代谢中线粒体功能变化是伤口愈合过程中巨噬细胞效应功能的关键调控机制。线粒体功能障碍，mtros增加会使炎症期中性粒细胞长期浸润，延缓巨噬细胞募集，影响肉芽增生及血管化的形成。如ⅱ型糖尿病患者线粒体功能障碍，活性氧的生成增加和atp合成减少；辐射对线粒体大分子和电子传递链造成损伤，初级和次级活性氧的产生增加，均可导致创面愈合时间延长。

3、近年来，有许多关于线粒体功能障碍的治疗方法。例如通过药物可以改善线粒体功能，如辅酶q10、可溶性鸟苷酸环化酶、nad+增强剂等；通过线粒体转移方式，将健康的线粒体转移至体内，替代功能异常的线粒体，进行代谢重编程，从而改善代谢障碍。但高ca2+浓度（大于2.0mm）的细胞外环境和氧化应激可能损害注入局部组织的外源性线粒体的活力，从而影响游离线粒体移植的治疗效果。近期的研究表明也通过细胞外囊泡转移线粒体改善能量代谢障碍，从而治疗小鼠的急性肺损伤及心肌梗死。因细胞外囊泡的脂质双分子层阻止了ca2+扩散，避免线粒体和相关内容物受到损害。因此，通过细胞外囊泡转移线粒体进行代谢重编程，从而改善巨噬细胞能量代谢障碍，促进慢性创面愈合，是一种可行性较强的治疗方法。

技术实现思路

1、本发明的目的为促进难愈性伤口愈合。

2、本发明首先保护一种富含活性线粒体的细胞外微囊泡的制备方法，可包括步骤（1）：用二甲双胍诱导培养脂肪间充质干细胞。

3、上述制备方法中，所述二甲双胍诱导培养的条件为：用浓度为50-100μm（如50-75μm、75-100μm、5μm、75μm或100μm）的二甲双胍诱导培养20-60h（如20-40h、40-48h、48-60h、20h、40h、48h或60h）。

4、上述制备方法中，所述脂肪间充质干细胞可通过商业途径购买获得，也可通过从脂肪组织（一般为新鲜皮下脂肪组织）中提取获得。

5、上述制备方法中，诱导培养时，所述脂肪间充质干细胞的细胞融合度可达到70-80%。

6、上述任一所述的制备方法还可包括步骤（2）和（3）：

7、（2）完成步骤（1）后，清洗并将培养基更换为含去外泌体的血清培养基，继续培养20-60h（如20-40h、40-48h、48-60h、20h、40h、48h或60h）；

8、（3）完成步骤（2）后，去除悬浮细胞、凋亡小体和细胞碎片，之后清洗，得到富含活性线粒体的细胞外微囊泡。

9、所述步骤（2）中，所述清洗可为用pbs缓冲液清洗1次以上（如2次、3次、4次）。

10、所述步骤（2）中，所述含去外泌体的血清培养基可为含5-15%（如5-10%、10-15%、5%、10%或15%）去外泌体的血清培养基。所述血清培养基可为exo-free血清培养基（赛业生物oricell®，cat#huxmd-90012）。

11、所述步骤（3）中，去除悬浮细胞、凋亡小体和细胞碎片通过离心实现。具体的，首先4℃、300g离心5min，收集上清（目的为去除悬浮细胞）。之后，继续4℃、2000g离心10min，收集上清（目的为去除凋亡小体及细胞碎片）。

12、所述步骤（3）中，所述清洗可为用pbs缓冲液清洗1次以上（如2次、3次、4次）。

13、上述任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡也属于本发明的保护范围。

14、本发明还保护一种负载富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片的制备方法，可包括如下步骤：

15、（a1）将脂肪组织脱细胞基质凝胶、甲基丙烯化透明质酸凝胶和上述任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡混匀，得到预凝胶溶液；

16、（a2）将预凝胶溶液加入微针模具，凝胶化后脱模，得到负载富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片。

17、上述制备方法中，所述甲基丙烯化透明质酸凝胶的浓度可为6%以上（如6%-10%、6%-8%、8%-10%、6%、8%或10%）。所述甲基丙烯化透明质酸凝胶的浓度优选为10%。

18、上述制备方法中，所述脂肪组织脱细胞基质凝胶的浓度为0.6%-1.2%（如0.6%-0.8%、0.8%-1.0%、1.0%-1.2%、0.6%、0.8%、1.0%或1.2%）。所述脂肪组织脱细胞基质凝胶的浓度优选为0.8%。

19、上述制备方法中，脂肪组织脱细胞基质凝胶和甲基丙烯化透明质酸凝胶的体积比具体可为1:1。

20、采用上述任一所述方法制备的负载富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片也属于本发明的保护范围。

21、本发明还保护一种微针贴片，其由采用上述任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡和凝胶原料制成。

22、本发明还保护采用上述任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡在制备微针贴片中的应用。

23、本发明还保护采用上述任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡在制备用于修复创面组织的产品中的应用。

24、本发明还保护采用上述任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡在制备用于促进难愈性伤口愈合的产品中的应用。

25、本发明还保护采用上述任一所述方法制备的负载富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片或由采用上述任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡和凝胶原料制成的微针贴片在制备用于修复创面组织的产品中的应用。

26、本发明还保护采用上述任一所述方法制备的负载富含活性线粒体的细胞外微囊泡的微针贴片或由采用上述任一所述方法制备的富含活性线粒体的细胞外微囊泡和凝胶原料制成的微针贴片在制备用于促进难愈性伤口愈合的产品中的应用。

27、上述任一所述的应用中，所述创面组织或难愈性伤口可为放射性复合伤或糖尿病足。

28、上述任一所述脂肪间充质干细胞可为成人脂肪间充质干细胞。

29、将透明质酸进行甲基丙烯化处理，使其具有可交联性和可形成凝胶的特性。将脂肪脱细胞基质与甲基丙烯化透明质酸混合，并通过交联反应形成凝胶。之后将凝胶注入微针贴片模具中，并进行交联固化，形成微针贴片的结构。微针贴片的制备使得修复材料具有微针状的结构，可以在贴片贴附到创面时穿透组织表面，将富含活性线粒体的细胞外微囊泡导入创面内部。微针的直径和长度可以根据需求进行调整，以适应不同类型和大小的创面。微针贴片中的甲基丙烯化透明质酸提供了一个保护性的屏障，防止创面感染，并提供湿润环境促进愈合。脂肪脱细胞基质则提供了细胞外基质支持和生物活性分子，促进创面上的细胞增殖和再生。这种创新的修复方法具有以下优势：（1）提供了一种简单且有效的创面修复方法，可以用于各种类型和大小的创面；（2）微针贴片的穿刺作用有助于富含活性线粒体的细胞外微囊泡导入和分布，增加了修复效果；（3）甲基丙烯化透明质酸和脂肪脱细胞基质的结合提供了双重的修复效果，有利于创面愈合；（4）微针贴片的制备相对简单，可以根据需要进行定制和批量生产。本发明制备的微针贴片可以促进如放射性复合伤的难愈性伤口愈合。本发明具有重要的应用价值。