一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体及其应用

本发明属于蛋白质工程改造，具体涉及一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体及其应用。

背景技术：

1、将生物酶制剂应用到洗涤剂中具有明显的技术难点，最为关键的是酶的本质是蛋白质，易受环境因素的影响，造成酶结构和性能的不稳定。蛋白酶是洗涤行业中应用最为广泛的生物酶制剂。

2、为了改进蛋白酶结构和性能，蛋白酶分子改造技术备受研究者关注，研究主要致力于蛋白酶性能改善，如提高低温活性、增强热稳定性、在特定ph值下提高比活性，调整ca2+依赖性等，以确保酶在其他洗涤剂成分存在的情况下依然保持活性和稳定性。为实现上述改进，科学工作者主要从两个方向进行研究：一是寻找天然存在的蛋白酶，即野生型蛋白酶；二是改造已知的蛋白酶(通过基因操作来修改编码该蛋白酶的核酸序列)。近年来计算化学的迅速发展提高了我们对蛋白质三维结构与功能之间关系的认识，从而更好地评估改变蛋白质的哪一区域来提高蛋白质特定性质的能力。

3、二硫键是蛋白质二级结构和三级结构的重要组成部分，在蛋白质分子中起着稳定肽链空间立体结构的作用。二硫键数目越多，蛋白质分子对抗外界因素影响的稳定性就愈大。因此本发明提供了一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体及其应用。

技术实现思路

1、本发明针对上述问题，提供了一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体。通过利用分子动力学计算方法对枯草芽孢杆菌源头的pb92碱性蛋白酶结构进行模拟，研究和评估了引入二硫键对pb92碱性蛋白酶结构特性和酶效能的影响。这一方法是目前唯一能够以原子水平探究pb92碱性蛋白酶结构和功能关系的有效途径。经过分子动力学计算，我们选定了合适的位点进行蛋白质工程改造，从而获得了适用于液体洗涤剂工业的突变体蛋白酶。这些蛋白酶突变体在碱性条件下表现出优异的催化活性和更好的稳定性，与液体洗涤剂中的其他成分相容性好，具备良好的去污性能，因此在洗涤工业领域具有广泛的应用前景。

2、为达到上述目的本发明采用了以下技术方案：

3、一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体，所述碱性蛋白酶突变体的亲本蛋白为枯草芽孢杆菌的pb92碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸残基对修饰置换位置为以下位置中的一对或多对：

4、7-199、71-86、50-104、49-107、48-92、45-89、44-87、249-261、247-267、247-266、200-210、173-196、148-169、121-222、116-145，所述位置对应于氨基酸序列seq id no.1的位置。

5、进一步，所述碱性蛋白酶突变体为t249c-l261c、t247c-a267c、t247c-a266c、g116c-v145c、a71c-a86c、f49c-q107c、g45c-y89c、r44c-e87c、a173c-g196c、v148c-m169c、n121c-a222c中的任意一对或多对位置上的氨基酸修饰置换。

6、进一步，所述碱性蛋白酶突变体为g116c-v145c、a71c-a86c、t249c-l261c中的任意两对或多对位置上氨基酸修饰置换。

7、进一步，所述碱性蛋白酶突变体为g116c-v145c、a71c-a86c、t249c-l261c这三对位置上的氨基酸修饰置换。

8、本发明还提供了一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体的应用，应用于清洁剂或洗涤剂。

9、本发明还提供了一种洗涤剂组合物，含有上述二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体。

10、本发明还提供了一种质粒，携带有编码上述二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体的基因。

11、本发明还提供了一种重组枯草芽孢杆菌，将上述质粒转入枯草芽孢杆菌中构建。

12、与现有技术相比本发明具有以下优点：

13、(1)本发明基于二硫键对蛋白结构和功能影响的理论设计，用分子动力学计算方法测试引入二硫键对pb92碱性蛋白酶突变体稳定性的影响。以分子动力学模拟结果中蛋白酶稳定性增加的百分比为基准，选择对pb92碱性蛋白酶稳定性贡献最大的二硫键对应的氨基酸残基位点进行蛋白质工程改造，获得了具有较高稳定性能的pb92碱性蛋白酶突变体。

14、(2)本发明的pb92碱性蛋白酶突变体稳定性与原碱性蛋白酶相比均有不同程度的提高。其中引入三个二硫键相对两个二硫键的稳定性明显提高，引入两个二硫键比一个二硫键的稳定性显著提高。对于引入单个二硫键，其中一个半胱氨酸(cys)位于催化三联体附近，另一个半胱氨酸位于蛋白酶表面形成的二硫键对pb92碱性蛋白酶稳定性提高最为明显。

15、(3)在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，添加本发明碱性蛋白酶突变体的标准液体洗涤剂的剩余酶活力更高，稳定性更好，可以用于洗涤剂或清洁剂中。

技术特征：

1.一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体的亲本蛋白为枯草芽孢杆菌的pb92碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸残基对修饰置换位置为以下位置中的一对或多对：

2.根据权利要求1所述的一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体为t249c-l261c、t247c-a267c、t247c-a266c、g116c-v145c、a71c-a86c、f49c-q107c、g45c-y89c、r44c-e87c、a173c-g196c、v148c-m169c、n121c-a222c中的任意一对或多对位置上的氨基酸修饰置换。

3.根据权利要求1所述的一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体为g116c-v145c、a71c-a86c、t249c-l261c中的任意两对或多对位置上氨基酸修饰置换。

4.根据权利要求1所述的一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体为g116c-v145c、a71c-a86c、t249c-l261c这三对位置上的氨基酸修饰置换。

5.一种权利要求1-4任一项所述二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体的应用，其特征在于，应用于清洁剂或洗涤剂。

6.一种洗涤剂组合物，其特征在于，含有权利要求1-4中任一项所述二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体。

7.一种质粒，其特征在于，携带有编码权利要求1-4任一项所述二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体的基因。

8.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将权利要求7所述质粒转入枯草芽孢杆菌中构建。

技术总结
本发明属于蛋白质工程改造技术领域，具体涉及一种二硫键修饰的碱性蛋白酶突变体及其应用。本发明首先基于引入二硫键的理论设计，用分子动力学计算方法测试引入二硫键对PB92碱性蛋白酶氨基酸稳定性的影响。以蛋白酶稳定性增加的百分比为基准，选择对PB92碱性蛋白酶稳定性贡献最大的二硫键对应氨基酸残基对位点进行蛋白质工程改造，获得了具有较高稳定性能的PB92碱性蛋白酶突变体，而且在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，添加本发明PB92碱性蛋白酶突变体的标准液体洗涤剂的剩余酶活力更高，稳定性更好，可以用于洗涤剂或清洁剂中。

技术研发人员：张剑,赵国伟,杨媛
受保护的技术使用者：山西大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6