一种检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒、新型鸭细小病毒的多重荧光PCR引物探针组及方法

本发明涉及生物信息检测领域，特别是涉及一种检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒、新型鸭细小病毒的多重荧光pcr引物探针组及方法。

背景技术：

1、鸭圆环病毒病(ducvd)是由鸭圆环病毒(duck circovirus，ducv)引起的疾病，可感染各品种及日龄鸭，不感染鹅，无明显季节性。既可水平传播，又可垂直传播。我国鸭群的感染率几乎是100％。临床主要有羽毛脱落、生长迟缓、饲料转换率低等表现特征。能够导致机体产生免疫抑制，继发细菌性病原的二次感染，致使鸭的病死率升高。近年来，ducv在我国鸭群中的单一感染及混合感染比例呈上升趋势。

2、鸭病毒性肠炎(dev)俗称鸭瘟(duck plague，dp)，是由鸭肠炎病毒(简称(dpv)引起的一种急性发热性传染病，通过接触传播，与败血症相关，以血管损伤、组织出血、消化道黏膜损伤和肠黏膜病变为特征。传播迅速，发病率和病死率都很高，是对世界范围水禽养殖业危害最严重的疫病之一。主要感染20日龄前后的鸭，开始少数发病，1-2天后出现死亡高峰，发病率和死亡率高达80％-100％。

3、鸭短喙-侏儒综合征是由新型鸭细小病毒(novel duck parvovirus,ndpv)引起的一种传染病，2014年11月以来，我国苏、鲁、豫、皖、冀等地相继出现，以雏鸭发育迟缓、上下喙短缩和舌头外伸为特征，养殖场俗称“大舌病”。鸭感染后，约有20％～30％的病鸭出现生长缓慢、体重不达标、残次鸭增多，胴体品质明显下降，严重影响鸭群的出栏体重和鸭肉产品质量。

4、目前，这三种病毒的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和elisa等，也有采用多重pcr进行鉴定的，但是传统方法存在耗时长、敏感性低等问题，限制了在实际工作中的应用。而现有的多重pcr多是结合常规的琼脂凝胶检测实现，该方法同样存在耗时长、耗费较多的人力和物力、毒性大不利于实验人员健康、灵敏度低等问题，因此，提供一种同时检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒三种病毒的新方法，对于解决现有技术中存在的问题非常重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒、新型鸭细小病毒的多重荧光pcr引物探针组及方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过三重荧光定量pcr反应，一次反应能够覆盖三种病原体检测并将其准确区分，相比于现阶段的免疫检测等传统技术，更加高效精准，并具有高度的特异性与专一性、扩增效率高、准确率高、重现性好，检测周期短等优势。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒的多重荧光定量pcr引物探针组，所述引物探针组包括：

4、如seq id no：1-2所示ducv引物对和seq id no：3所示rep探针，其用于检测所述鸭圆环病毒；

5、如seq id no：4-5所示dev引物对和seq id no：6所示ul6/ul7探针，其用于检测所述鸭肠炎病毒；

6、如seq id no：7-8所示ndpv引物对和seq id no：9所示vp1探针，其用于检测所述新型鸭细小病毒。

7、本发明还提供一种检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒的多重荧光定量pcr试剂盒，包含所述的引物探针组。

8、本发明还提供一种鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒的多重荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：

9、以待测样品的dna为模板，利用所述的引物探针组进行多重荧光定量pcr扩增反应，根据pcr扩增曲线有无和ct值判断所述待测样品是否含有鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒。

10、优选的是，所述多重荧光定量pcr扩增反应的反应体系包括：

11、qpcr预混液10μl，ducv引物对各引物0.2μl、rep探针0.1μl，dev引物对各引物0.2μl、ul6/ul7探针0.1μl，ndpv引物对各引物0.6μl、vp1探针0.2μl，ducv模板、dev模板和ndpv模板各1μl，ddh2o补足至20μl。

12、优选的是，所述多重荧光定量pcr扩增反应的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，57℃退火和延伸30s，共40个循环。

13、优选的是，所述判断的方法为：若有扩增曲线，且满足ct≤35，则说明所述待测样品含有鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒中的至少一种，为阳性；若无扩增曲线，则说明所述待测样品不含鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒中的任何一种。

14、优选的是，所述鸭圆环病毒的检测通道为rox通道，所述鸭肠炎病毒的检测通道为fam通道，所述新型鸭细小病毒的检测通道为hex通道；

15、若所述rox通道ct值≤35时视为鸭圆环病毒阳性，否则为鸭圆环病毒阴性；若所述hex通道ct值≤35时视为新型鸭细小病毒阳性，否则为新型鸭细小病毒阴性；若所述fam通道ct值≤35时视为鸭肠炎病毒阳性，否则为鸭肠炎病毒阴性。

16、本发明还提供所述的pcr引物探针组或所述的试剂盒在制备检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒的产品中的应用。

17、本发明公开了以下技术效果：

18、本发明提供了一种检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒的多重荧光定量pcr引物探针组，并利用该引物探针组构建检测方法，经实验验证，利用该检测方法进行重复性检测，成本低、重复性好、检测时间短、具有良好的特异性和灵敏度。本发明的检测方法最低检测限可达到每种病毒2.28×101拷贝数/μl；本发明所设计的鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒、新型鸭细小病毒的引物探针组特异性高，不会产生交叉反应造成假阳性。

19、本发明提供的检测方法首次提供了可以同时检验诊断鸭圆环病毒(ducv)、鸭肠炎病毒(dev)、新型鸭细小病毒(ndpv)的荧光定量pcr检测方法，填补了市场上这三种病毒同时检测方法的缺口，完善了针对鸭类病毒临床诊断的医疗体系。针对国内新发鸭病相关病毒进行检测鉴定和监控，相比传统方法在提高效率和精准度的同时降低人力与物力消耗，高效并便捷地对常见鸭病做出病原诊断。

技术特征：

1.一种检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒的多重荧光定量pcr引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括：

2.一种检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒的多重荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物探针组。

3.一种鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒的多重荧光定量pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述多重荧光定量pcr扩增反应的反应体系包括：

5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述多重荧光定量pcr扩增反应的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，57℃退火和延伸30s，共40个循环。

6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述判断的方法为：若有扩增曲线，且满足ct≤35，则说明所述待测样品含有鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒中的至少一种，为阳性；若无扩增曲线，则说明所述待测样品不含鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒中的任何一种。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述鸭圆环病毒的检测通道为rox通道，所述鸭肠炎病毒的检测通道为fam通道，所述新型鸭细小病毒的检测通道为hex通道；

8.如权利要求1所述的pcr引物探针组或权利要求2所述的试剂盒在制备检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒和新型鸭细小病毒的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种检测鸭圆环病毒、鸭肠炎病毒、新型鸭细小病毒的多重荧光PCR引物探针组及方法，属于生物信息检测领域。该引物探针组包括：如SEQ ID NO：1‑2所示DuCV引物对和SEQ ID NO：3所示Rep探针，其用于检测鸭圆环病毒；如SEQ ID NO：4‑5所示DEV引物对和SEQ ID NO：6所示UL6/UL7探针，其用于检测鸭肠炎病毒；如SEQ ID NO：7‑8所示NDPV引物对和SEQ ID NO：9所示VP1探针，其用于检测新型鸭细小病毒。本发明通过一次反应检测三种病原体，具有高度的特异性与专一性、扩增效率高、准确率高、重现性好、检测周期短的优势，具有高度可行性与应用前景。

技术研发人员：孟凯,刘霞,杨孟豪,董雯雯,李丽湲,袁小远,张玉霞,李桂明
受保护的技术使用者：山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22