一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌及构建方法和应用

本发明属于生物工程，特别涉及一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌及构建方法和应用。

背景技术：

1、吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,pca)是一种重要的天然含氮杂环的芳香族化合物，因其具有显著的农用和医用活性以及电子传递功能，在农业和医药领域有广泛的应用。现有生物合成技术中，吩嗪-1-羧酸主要通过假单胞菌发酵来获得，由此合成的吩嗪-1-羧酸已被开发为我国自主研发的一种新型微生物源农药“申嗪霉素”，具有高效、安全、广谱等特点。

2、然而，假单胞菌在发酵中以葡萄糖或甘油为底物，通过发酵生产化学品(如天然产物)的成本通常取决于所使用的碳源。糖通常是成本较高的碳源，同时糖基原料的过度依赖存在“与人争粮，与粮争地”的问题。随着第三代生物炼制技术的发展，极具成本效益且资源丰富的可再生一碳资源甲烷(ch4)被认为是极具潜力的下一代生物制造原料。利用甲烷原料合成吩嗪-1-羧酸的技术路线是完全可行。迄今为止，虽然已构建多种转化甲烷合成化学品的工程菌株，但是这些产物多集中在有机酸、生物蛋白、萜类化合物等，由天然嗜甲烷菌转化甲烷合成生物农药，尤其是合成吩嗪-1-羧酸的方法尚未报道。嗜甲烷菌中特有的甲烷单加氧酶(particulate methane monooxygenase，pmmo)是甲烷利用关键酶，其可将甲烷氧化为甲醇加以利用。因该反应过程需要电子供给，电子传递效率是甲烷氧化的主要瓶颈之一。吩嗪-1-羧酸具有优良的电子传递特性，因此通过转化甲烷内源合成吩嗪-1-羧酸强化电子传递，在甲烷合成高值产物的同时，也能够促进pmmo酶活，从而提高嗜甲烷菌的甲烷利用效率，是一个亟待研究的方向。

技术实现思路

1、为了客服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌及构建方法和应用，通过代谢路径设计，构建产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷菌工程菌，通过电子传递过程强化促进甲烷氧化效率，从而提高吩嗪-1-羧酸的产量，实现甲烷高效生物转化。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

3、一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，包括嗜甲烷菌宿主，以及嗜甲烷菌宿主中引入的外源吩嗪-1-羧酸合成的基因簇phzabcdefg。

4、所述的嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(methylomonas)、甲基杆菌属(methylobacter)、甲基球菌属(methylococcus)、甲基微菌(methylomicrobium)、甲基球形属(methylosphaera)、甲基热菌(methylocaldum)、甲基八叠球菌属(methylosarcina)、甲基弯曲菌属(methylosinus)、甲基孢囊菌属(methylocystis)、甲基细胞菌属(methylocella)和甲基帽菌属(methylocapsa)中的一种。

5、所述的甲基微菌是methylotuvimicrobium buryatense或methylotuvimicrobiumalcaliphilum；

6、methylotuvimicrobium buryatense具体为methylotuvimicrobium buryatense5gb1c；methylotuvimicrobium alcaliphilum具体为methylotuvimicrobiumalcaliphilum 20z。

7、所述外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzabcdefg，来自铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa pao1，其核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。

8、一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的构建方法，通过基因组整合的方法将外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇整合在嗜甲烷菌宿主基因组中，从而完成宿主异源吩嗪-1-羧酸合成模块的搭建。

9、所述构建方法具体如下：

10、(1)、将外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzabcdefg与ptac启动子串联得到ptac-phz片段；将外源基因片段ptac-phz、loxp位点与质粒puc57相连构建重组质粒puc57-ptac-phz；

11、所述ptac启动子核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；

12、(2)、克隆puc57-ptac-phz质粒中的线性化片段loxp-ptac-phz-gm-loxp，将该线性化片段电转至含有loxp整合位点的嗜甲烷菌宿主中，获得产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷菌工程菌；利用该策略同样获得由pmaxf驱动的吩嗪合成基因簇工程菌。

13、所述的ptac启动子能够替换成pmaxf启动子，串联得到pmaxf-phz片段，与质粒puc57相连构建重组质粒puc57-pmaxf-phz；

14、所述pmaxf启动子核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。

15、一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的应用，以一碳化合物为碳源，在嗜甲烷菌中合成吩嗪-1-羧酸，应用在微生物源吩嗪-1-羧酸及其衍生物的生产中。

16、所述的一碳化合物包括甲烷、甲醇或沼气。

17、所述的吩嗪-1-羧酸基于其农用和医用活性以及电子传递功能，应用在农业生物防治中或应用在生产甲烷减排中。

18、本发明有益效果体现在：

19、1、本发明提供一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷菌工程菌，通过引入异源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzabcdefg，构建一条可以利用一碳化合物(甲烷、甲醇或沼气)为底物生成吩嗪-1-羧酸的代谢通路；通过吩嗪-1-羧酸合成强化电子传递效率，也能够促进甲烷碳转化率。

20、2、基于本发明所述的嗜甲烷菌工程菌，能够产吩嗪-1-羧酸，利用一碳化合物(甲烷、甲醇或沼气)为碳源，原料成本低廉，工艺操作简单，菌株可以重复使用，有助于农业生产中甲烷减排及病虫害生物防治；利用甲烷生产吩嗪-1-羧酸为商业化利用沼气生产吩嗪-1-羧酸及其衍生物提供借鉴。

技术特征：

1.一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，其特征在于，包括嗜甲烷菌宿主，以及嗜甲烷菌宿主中引入的外源吩嗪-1-羧酸合成的基因簇phzabcdefg。

2.根据权利要求1所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述的嗜甲烷菌宿主选自甲基单胞菌属(methylomonas)、甲基杆菌属(methylobacter)、甲基球菌属(methylococcus)、甲基微菌(methylomicrobium)、甲基球形属(methylosphaera)、甲基热菌(methylocaldum)、甲基八叠球菌属(methylosarcina)、甲基弯曲菌属(methylosinus)、甲基孢囊菌属(methylocystis)、甲基细胞菌属(methylocella)和甲基帽菌属(methylocapsa)中的一种。

3.根据权利要求2所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述的甲基微菌是methylotuvimicrobium buryatense或methylotuvimicrobium alcaliphilum；

4.根据权利要求1所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇phzabcdefg，来自铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa pao1，其核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，通过基因组整合的方法将外源吩嗪-1-羧酸合成基因簇整合在嗜甲烷菌宿主基因组中，从而完成宿主异源吩嗪-1-羧酸合成模块的搭建。

6.根据权利要求5所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体如下：

7.根据权利要求6所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的构建方法，其特征在于，所述的ptac启动子能够替换成pmaxf启动子，串联得到pmaxf-phz片段，与质粒puc57相连构建重组质粒puc57-pmaxf-phz；

8.一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的应用，其特征在于，以一碳化合物为碳源，在嗜甲烷菌中合成吩嗪-1-羧酸，应用在微生物源吩嗪-1-羧酸及其衍生物的生产中。

9.根据权利要求8所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的应用，其特征在于，所述的一碳化合物包括甲烷、甲醇或沼气。

10.根据权利要求8所述的一种产吩嗪-1-羧酸的嗜甲烷工程菌的应用，其特征在于，所述的吩嗪-1-羧酸基于其农用和医用活性以及电子传递功能，应用在农业生物防治中或应用在生产甲烷减排中。

技术总结
一种产吩嗪‑1‑羧酸的嗜甲烷工程菌及构建方法和应用，嗜甲烷工程菌通过基因组整合的方法将外源吩嗪‑1‑羧酸合成基因簇整合在嗜甲烷菌宿主基因组中，从而完成宿主异源吩嗪‑1‑羧酸合成模块的搭建；以一碳化合物为碳源，在嗜甲烷菌中合成吩嗪‑1‑羧酸，应用在微生物源吩嗪‑1‑羧酸及其衍生物的生产中；吩嗪‑1‑羧酸基于其农用和医用活性以及电子传递功能，通过电子传递过程强化促进甲烷氧化效率，从而提高吩嗪‑1‑羧酸的产量，实现甲烷高效生物转化。

技术研发人员：郭树奇,黄小涵,费强
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6