通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素SEE阳性金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒与检测方法

本发明属于生物，特别涉及一种通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒与检测方法。

背景技术：

1、金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性病原菌，经常通过产生肠毒素而引起人们呕吐、腹泻，严重的可能导致休克。金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins，ses)主要有sea～see这5种，see作为金黄色葡萄球菌主要的肠毒素之一，其检测工作十分重要。

2、目前检测金黄色葡萄球菌肠毒素see的主要方法为三类：免疫学方法、质谱/色谱分析方法和分子生物学方法。免疫学方法成本较高且特异性较差；质谱色谱分析方法耗时长，材料和仪器价格昂贵，应用较少；分子生物学的方法目前主要是pcr和实时荧光定量pcr，它们都需要变温的设备，检测时间也不够短。因此，目前针对金黄色葡萄球菌肠毒素see的检测方法不能够完全满足人们的需要。

3、聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction，psr)技术，是一种新兴的恒温扩增技术，可以在恒温条件下快速实现靶序列的扩增，不需要控制温度的设备，操作便捷，适用性广。该检测技术不但可以满足各种食品工厂与食品安全检测机构对食品质量安全检测的需要，而且在现场检测领域具有十分突出的优势，符合目前检测技术的方便快捷化的发展趋势。因此建立一种针对金黄色葡萄球菌肠毒素see的具有独立知识产权的聚合酶螺旋反应的检测方法具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种psr恒温扩增金黄色葡萄球菌肠毒素see的引物。

2、本发明的另一目的在于提供一种肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的聚合酶螺旋恒温反应的试剂盒。

3、本发明的又一目的在于提供一种肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的聚合酶螺旋恒温反应的方法。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、一种通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的引物，由一对检测引物ft和bt构成，其核苷酸序列如下：

6、检测引物ft：5’-tttgttttccgtctatccacgataataaccgattgaccg-3’(seq idno.1)；

7、检测引物bt：5’-cacctatctgccttttgtttcgtgtaaataatgccttgc-3’(seq idno.2)。

8、一种通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括上述通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的引物。

9、所述的试剂盒中扩增引物ft与bt的浓度均为50μm。

10、所述的试剂盒，还包括如下组分：

11、a、2×反应缓冲液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween 20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps；

12、b、bst dna聚合酶；

13、c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

14、组分b中所述的bst dna聚合酶优选为浓度为8u/μl的bst dna聚合酶水溶液。

15、组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过以下方法制备：

16、(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置成浓度为50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置成浓度为1mm的氯化锰水溶液；

17、(ii)取25μl 50μm的钙黄绿素溶液与10μl 1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1:8)。

18、上述的通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的引物或通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的试剂盒在检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌中的应用。

19、一种根据上述试剂盒通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的实验研究方法，包括如下步骤：

20、(1)提取待检样品的细菌dna作为模板，并保证模板dna水溶液的od260/od280值在1.8～2.0的范围内；

21、(2)于65℃水浴中保温60分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为26μl反应体系：2×反应缓冲液12.5μl，50μm的检测引物ft和50μm的检测引物bt各0.8μl，dna模板2.0μl，8u/μl的bst dna聚合酶1.0μl，去离子水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；

22、(3)待反应完成后于80℃水浴中加热2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如反应液颜色仍为橙色，说明待检样品中不含金黄色葡萄球菌肠毒素see；如反应液颜色变为绿色，说明待检样品中含有金黄色葡萄球菌肠毒素see。同样的，取反应液进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳结果无条带，说明待检样品中不含金黄色葡萄球菌肠毒素see；若电泳结果呈梯形条带，说明待测样品中含有金黄色葡萄球菌肠毒素see。

23、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

24、(1)本发明中所提供的针对金黄色葡萄球菌肠毒素see特异性靶序列所设计的聚合酶螺旋反应检测鉴定方法，解决了现有技术方法检测时间长，操作复杂，检测成本高的问题。

25、(2)本发明的技术方法在恒温条件下即可进行反应，不需要进行变温，可以省去常规分子生物学方法所需的变温时间，在60分钟左右就可获得检测结果，大大缩短了检测金黄色葡萄球菌肠毒素see所需时间。此外，该方法不用任何昂贵的仪器，也可以不需要进行凝胶电泳判断检测结果，采用的是荧光染料进行显色，仅凭肉眼就可判断检测结果。本发明的试剂盒及方法特别适用于各种中小型食品企业产品的质量监控和现场检测。同时，本发明还公开了针对金黄色葡萄球菌肠毒素see的特异性靶序列保守区的特异区域设计的一对检测引物，可以确保检测结果的可靠。

技术特征：

1.一种通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的引物，由一对检测引物ft和bt构成，其特征在于核苷酸序列如下：

2.一种通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于：

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：

7.权利要求1所述的通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的引物或权利要求2～6任一所述的通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌的试剂盒在检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌中的应用。

8.一种根据权利要求2～6任一所述的试剂盒通过聚合酶螺旋恒温反应检测肠毒素see阳性金黄色葡萄球菌实验研究方法，其特征在于包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种肠毒素SEE阳性金黄色葡萄球菌的聚合酶螺旋恒温反应的引物、试剂盒及检测方法。该引物包括检测引物Ft和Bt；其中，检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了一种肠毒素SEE阳性金黄色葡萄球菌的聚合酶螺旋恒温反应的试剂盒，该试剂盒包括上述引物，Bst DNA聚合酶，以及钙黄绿素和氯化锰的混合溶液等。利用上述引物或试剂盒能对金黄色葡萄球菌肠毒素SEE进行聚合酶螺旋反应恒温扩增，在60分钟内即可得到检测结果，该检测方法的灵敏度高、特异好，操作简便，并且所需成本低廉。本发明对新型恒温扩增技术的应用和普及可产生积极影响，对提高现场检测准确性有巨大的推动作用。

技术研发人员：徐振波,李娅琴,李雪杰,刘君彦,金河坡
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22