Ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用与流程

本申请属于动物模型领域，具体涉及一种ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、精子异常症分为精液异常和精子异常两类，前者指精液量的多寡，颜色异常、质的异常，后者指精子量的多少，质的异常、畸形等。

2、导致少精子症的原因包括以下7个方面：1、精索静脉曲张时，使睾丸的局部温度升高，血管活性物质增加，从而影响睾丸生精功能。但精索静脉曲张程度与精子质量不成比例。2、隐睾是影响精液质量的重要原因之一。单侧隐睾约60%病人不育，因此若精子密度低，又有隐睾存在，必须及早治疗。3、生殖道感染附属生殖腺的慢性感染，可以影响精液中的各种化验指标。4、自身免疫生殖免疫学研究发现，男性自身免疫可影响生育能力，抗精子抗体可影响精子的产生和运送。5、内分泌异常男性正常生精功能依赖于下丘脑—垂体—性腺轴功能的正常，其中任何一个环节障碍，都会影响生精功能，其它如甲状腺、肾上腺疾病也会影响生殖腺功能而致少精子症。6、染色体异常染色体畸变对精子密度、活动率及形态均有严重影响。7、其它阴囊温度过高，放射损伤，化学毒品及药物影响均可造成少精子症。

3、男性精子异常是一起不孕不育的重要病因。为更加充分详细的了解精子发生，为男性不育提供新的诊断和治疗思路，需要对相关致病基因进行挖掘和功能探究。ccdc182基因（coiled-coil domain containing 182），其定位于小鼠11号染色体上nc_000077.7（88184869-88186087），在小鼠中有1个转录本（nm_028859.1），全长1219bp，包含1个外显子，编码的蛋白质包含153个氨基酸残基。

4、目前，尚未有关ccdc182基因敲除小鼠模型用于研究男性不育患者的突变的相关报道。

技术实现思路

1、基于此，本申请一实施例提供一种ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法和应用，以用于研究男性不育患者的突变。

2、一种构建ccdc182基因敲除小鼠模型的试剂盒，所述试剂盒包括sgrna1与sgrna2。

3、所述sgrna1的序列如seq id no.1所示；所述sgrna2的序列如seq id no.2所示。

4、在其中一个实施例中，还包括对应的检测引物。

5、所述检测引物的序列如seq id no.3~seq id no.4所示。

6、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括cas9 mrna。

7、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括taq dna聚合酶、dntps和mg2+中的一种或多种。

8、一种ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

9、（1）获取靶向小鼠ccdc182基因的sgrna1与sgrna2；

10、所述sgrna1的序列如seq.id.no.1所示；所述sgrna2的序列如seqidno.2所示。

11、（2）采用所述sgrna1与所述sgrna2构建sgrna/cas9表达载体，体外转录，制备mrna。

12、（3）将所述mrna引入假孕母鼠体内，制备f0代小鼠。

13、（4）从所述f0代小鼠中筛选ccdc182基因基因敲除稳定的小鼠遗传系，将阳性f0代小鼠与野生型小鼠杂交得到f1代杂合子小鼠，及将f1代杂合子小鼠交配得到稳定遗传变异的f2代ccdc182基因基因敲除纯合小鼠。

14、在其中一个实施例中，小鼠品系选自c57bl/6。

15、在其中一个实施例中，采用pcr法鉴定阳性小鼠，pcr法进行筛选时所使用的检测引物如seq id no.3和seq id no.4所示。

16、在其中一个实施例中，pcr法进行筛选时的扩增程序为：预变性程序95℃条件反应3min；变性程序95℃条件反应30s，退火程序60℃条件反应60s，延伸程序72℃条件反应60s，变性至延伸共34个循环；最后彻底延伸程序72℃条件反应5min，反应结束短期储存4℃保存，长期储存-20℃保存。

17、本申请另一方面提供上述的试剂盒或上述构建方法得到的ccdc182基因敲除小鼠模型在药物筛选中的应用。

18、在其中一个实施例中，其特征在于所述药物包括治疗精子发生障碍的药物。

19、相对于传统技术，本申请的有益效果包括：

20、本申请一实施例提供一种ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法，设计靶向目标位点的sgrna序列，利用crispr/cas9技术可以高效、精准的构建ccdc182基因敲除小鼠模型用于后续功能学研究。

21、本申请通过crispr/cas9技术构建了ccdc182（nm_028859.1）基因敲除小鼠动物模型，对于进一步研究ccdc182基因的功能以及其在小鼠或者人类的少弱畸形精子症中的遗传学研究奠定了良好的基础。

技术特征：

1.一种构建ccdc182基因敲除小鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括sgrna1、sgrna2；

2.根据权利要求1所述的构建ccdc182基因敲除小鼠模型的试剂盒，其特征在于，还包括对应的检测引物；

3.根据权利要求1所述的构建ccdc182基因敲除小鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas9 mrna。

4.根据权利要求1所述的构建ccdc182基因敲除小鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括taq dna聚合酶、dntps和mg2+中的一种或多种。

5.一种ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，小鼠品系选自c57bl/6。

7.根据权利要求5或6所述的ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用pcr法鉴定阳性小鼠，pcr法进行筛选时所使用的检测引物如seq id no.3和seq id no.4所示。

8.根据权利要求5或6所述的ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，pcr法进行筛选时的扩增程序为：94℃~96℃条件反应4min~6min；93℃~95℃条件反应25s~35s；55℃~65℃条件反应28s~32s；70℃~74℃条件反应38s~42s，共35个循环；70℃~74℃条件反应4min~6min，3.5℃~4.5℃保存。

9.权利要求1~4任一项所述的试剂盒或权利要求5~9任一项所述构建方法得到的ccdc182基因敲除小鼠模型在药物筛选中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述药物包括治疗精子发生障碍的药物。

技术总结
本申请属于动物模型领域，具体涉及一种Ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法与应用。本申请提供了一种Ccdc182基因敲除小鼠模型的构建方法，设计靶向目标位点的sgRNA序列，利用CRISPR/Cas9技术可以高效、精准的构建Ccdc182基因敲除小鼠模型用于后续功能学研究。本申请通过CRISPR/Cas9技术构建了Ccdc182（NM_028859.1）基因敲除小鼠动物模型，对于进一步研究Ccdc182基因的功能以及其在小鼠或者人类的少弱畸形精子症中的遗传学研究奠定了良好的基础。

技术研发人员：郑伟,万纤,戴菁,林戈
受保护的技术使用者：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1