检测饲料及原料中常见致病菌相关扩增引物、试剂盒及其应用

本发明具体涉及检测饲料及原料中常见致病菌相关扩增引物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、饲料是畜牧业发展的命脉，饲料质量安全与畜产品质量安全息息相关。作为畜禽的主要食物来源，饲料质量不仅直接决定畜禽肉质好坏，还间接影响环境以及人类的健康。饲料含有丰富的碳水化合物、脂肪、蛋白质及维生素等营养物质，在加工、运输及储藏过程中极易被微生物感染，例如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、大肠埃希氏菌等。微生物大量繁殖不仅会导致饲料营养成分遭到破坏，还会产生具有强毒性的毒素。被污染的饲料用于饲养动物除了会造成动物中毒发病，给养殖者带来巨大的经济损失；在患病动物治疗过程可能存在抗生素滥用或过量使用的现象，从而引起细菌耐药，存在潜在的耐药菌传播风险；还会在动物体内富集通过畜产品进入人体，危害人体健康。因此，应大力控制微生物对饲料的污染，加强对饲料微生物的检测，对我国畜牧业健康发展有重要意义。

2、目前针对饲料中致病菌的检测以微生物培养和鉴定法为主。传统培养方法检测致病菌，增菌及选择分离方法各不相同，需要用到大量培养基和生化试剂，且操作较复杂，检测周期长(约5-7days)，当选择分离效果不好时，容易因为没挑到菌而漏检，这无疑增加了企业对于饲料储藏成本及质量控制的成本，也加大了政府对于饲料安全的监管难度。目前与饲料中微生物检测相关的标准仍局限于沙门氏菌、大肠菌群、霉菌总数、蜡样枯草芽孢杆菌等少数几种菌的检测，对其他常见微生物则只能参照食品中的致病菌的检测，一般按照有关标准方法主要依赖于传统的分离鉴定，针对于每种致病菌均需要其特定的增菌培养基进行增菌，选择性增菌等步骤；同一样品需要同时进行多种致病菌的检测，这样就需要同时在多种特定的增菌培养基上进行样品的增菌处理，造成检测工作前期增菌过程繁琐，且培养条件多不同。

3、实时荧光定量pcr技术准确度和灵敏度高，与传统的基于微生物培养的检测方法相比更加省时省力。但受其荧光通道的限制，目前单管荧光pcr最多能检测3个靶标左右，针对大于3个致病菌的检测，只能分两管甚至更多管进行，工作量大，不利于同时针对多个(＞6)靶标的同时筛检。而且荧光定量pcr对操作者的操作熟练程度及结果分析要求较高。

4、基因膜芯片法利用“反向斑点杂交技术(rdb)”，将待测靶标基因中的特异性序列作为探针固定在尼龙膜上，同时利用多对带生物素标记的引物对待测靶标基因进行扩增，通过酶-底物显色，产生肉眼可辨的信号。具有快速、准确、高通量、平行化等优点，解决了荧光定量pcr技术检测通量低的问题，单次反应可同时筛检数十种指标。但多重pcr在的引物除了考虑引物特异性外，还要考虑不同引物之间的相互作用、错配以及竞争等情况，检测目标量越大，引物设计难度就越大。

5、因此，利用膜芯片技术检测平台开发一种快速、简便、高通量的检测常见致病菌相关扩增引物、试剂盒及其应用是目前待决解的技术问题。

技术实现思路

1、发明要解决的技术问题是提供一种鉴定或辅助鉴定沙门氏菌、大肠埃希氏菌o157:h7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌及产气荚膜梭菌的多重pcr引物，进一步提供了与扩增产物特异性结合的探针，上述引物和探针配合用于对上述致病菌的反向斑点杂交检测。

2、为了解决上述问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定常见致病菌的多重pcr引物组合物。

3、所述引物组合物包括引物对a、引物对b、引物对c、引物对d、引物对e、引物对f、引物对g、引物对h和引物对k这9对引物中的9对、8对、7对、6对、5对、4对、3对、2对或1对；

4、所述引物对a由a-f和a-r组成，所述a-f是核苷酸序列为seq id no.1的单链dna分子，a-r是核苷酸序列为seq id no.2的单链dna分子；

5、所述引物对b由b-f和b-r组成，所述b-f是核苷酸序列为seq id no.4的单链dna分子，b-r是核苷酸序列为seq id no.5的单链dna分子；

6、所述引物对c由c-f和c-r组成，所述c-f是核苷酸序列为seq id no.7的单链dna分子，c-r是核苷酸序列为seq id no.8的单链dna分子；

7、所述引物对d由d-f和d-r组成，所述d-f是核苷酸序列为seq id no.10的单链dna分子，d-r是核苷酸序列为seq id no.11的单链dna分子；

8、所述引物对e由e-f和e-r组成，所述e-f是核苷酸序列为seq id no.13的单链dna分子，e-r是核苷酸序列为seq id no.14的单链dna分子；

9、所述引物对f由f-f和f-r组成，所述f-f是核苷酸序列为seq id no.16的单链dna分子，f-r是核苷酸序列为seq id no.17的单链dna分子；

10、所述引物对g由g-f和g-r组成，所述g-f是核苷酸序列为seq id no.19的单链dna分子，g-r是核苷酸序列为seq id no.20的单链dna分子；

11、所述引物对h由h-f和h-r组成，所述h-f是核苷酸序列为seq id no.22的单链dna分子，h-r是核苷酸序列为seq id no.23的单链dna分子；

12、所述引物对k由k-f和k-r组成，所述k-f是核苷酸序列为seq id no.31的单链dna分子，k-r是核苷酸序列为seq id no.32的单链dna分子；

13、所述常见致病菌为沙门氏菌、大肠埃希氏菌o157:h7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌和产气荚膜梭菌这9种致病菌的9种、8种、7种、6种、5种、4种、3种、2种或1种。

14、所述为大肠埃希氏菌o157:h7。

15、上文中，所述至少一种包括至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少九种。

16、上文中，所述对引物对a、引物对b、引物对c、引物对d、引物对e、引物对f、引物对g、引物对h和引物对k中至少有一条引物具有标记物。可为a-r、b-r、c-r、d-r、e-r、f-f、g-r、h-f、k-r引物具有标记物。所述标记物可为生物素。可为a-r、b-r、c-r、d-r、e-r、f-f、g-r、h-f、k-r引物的5′端具有生物素修饰。

17、上述引物组合物中，所述a-f、a-r、b-f、b-r、c-f、c-r、d-f、d-r、e-f、e-r、f-f、f-r、g-f、g-r、h-f、h-r、k-f和k-r的物质的量比为170：255：500：750：170：255：350：525：100：150：300：200：200：300：450：300：200：300。

18、上述的引物组合物中，还包括引物对i和引物对j中的至少一种；

19、所述引物对i由i-f和i-r组成，所述i-f是核苷酸序列为seq id no.25的单链dna分子，i-r是核苷酸序列为seq id no.26的单链dna分子；

20、所述引物对j由j-f和j-r组成，所述j-f是核苷酸序列为seq id no.28的单链dna分子，j-r是核苷酸序列为seq id no.29的单链dna分子。

21、上文中，所述对引物对i和引物对j中至少有一条引物具有标记物。可为i-f、j-f引物具有标记物。所述标记物可为生物素。可为i-f、j-f的5′端具有生物素修饰。

22、上述的引物组合物中，所述a-f、a-r、b-f、b-r、c-f、c-r、d-f、d-r、e-f、e-r、f-f、f-r、g-f、g-r、h-f、h-r、i-f、i-r、j-f、j-r、k-f和k-r的物质量比为170：255：500：750：170：255：350：525：100：150：300：200：200：300：450：300：675：450：450：300：200：300。

23、上文中，所述引物组合物还包括引物对l由l-f和l-r组成，所述l-f是核苷酸序列为seq id no.34的单链dna分子，l-r是核苷酸序列为seq id no.35的单链dna分子。

24、上文中，所述对引物对l中至少有一条引物具有标记物。可为l-r引物具有标记物。所述标记物可为生物素。可为l-r的5′端具有生物素修饰。

25、所述a-f、a-r、b-f、b-r、c-f、c-r、d-f、d-r、e-f、e-r、f-f、f-r、g-f、g-r、h-f、h-r、i-f、i-r、j-f、j-r、k-f、k-r、l-f和l-r的物质量比为170：255：500：750：170：255：350：525：100：150：300：200：200：300：450：300：675：450：450：300：200：300：200：300。

26、上述探针或引物序列中，k为g或t，r为a或g，y为t或c，w为a或t，d为a、g或t，h为a或c或t，m为a或c，k为g或t。

27、为了解决上述问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定鉴定或辅助鉴定常见致病菌的产品。

28、所述产品包括下述任一种：

29、d1)含有上述引物组合物的体外核酸扩增试剂；

30、d2)含有上述引物组合物或d1)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；

31、d3)含有上述引物组合物、d1)所述体外核酸扩增试剂或d2)所述试剂盒的检测仪器。

32、上述的引物组合物或上述的产品在下述任一中的应用；

33、e1)用于辅助检测或检测样本中是否含有常见致病菌；

34、e2)用于制备辅助检测或检测样本中是否含有常见致病菌的产品。

35、上文中，对引物对a可对沙门氏菌特异性扩增，引物对b可对金黄色葡萄球菌特异性扩增，引物对c可对大肠埃希氏菌o157:h7特异性扩增，引物对d可对志贺氏菌特异性扩增，引物对e可对空肠弯曲杆菌特异性扩增，引物对f可对单核细胞增生李斯特氏菌特异性扩增，引物对g可对产气荚膜梭菌特异性扩增，引物对h可对副溶血性弧菌特异性扩增，引物对i可对蜡样芽孢杆菌bcet基因特异性扩增，引物对j可对蜡样芽孢杆菌entfm特异性扩增，引物对k可对蜡样芽孢杆菌gyrb特异性扩增。引物对l可对内参特异性扩增。

36、上文中，所述常见致病菌为沙门氏菌、大肠埃希氏菌o157:h7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌或产气荚膜梭菌中的至少一种。所述大肠埃希氏菌可为大肠埃希氏菌o157:h7。

37、上述的引物组合物、上述的生物材料或上述的引物组合物或生物材料中，所述常见致病菌为沙门氏菌、大肠埃希氏菌o157:h7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌或产气荚膜梭菌中的一种或多种。

38、为了解决上述问题，本发明提供了一种检测鉴定或辅助鉴定常见致病菌的试剂盒。

39、所述试剂盒包括如上任一所述的引物组合物，还包括探针a、探针b、探针c、探针d、探针e、探针f、探针g、探针h、探针i、探针j和探针k中的至少一种；

40、所述核酸探针a是核苷酸序列为seq id no.3的核酸分子；所述核酸探针b是核苷酸序列为seq id no.6的核酸分子；所述核酸探针c是核苷酸序列为seq id no.9的核酸分子；所述核酸探针d是核苷酸序列为seq id no.12的核酸分子；所述核酸探针e是核苷酸序列为seq id no.15的核酸分子；所述核酸探针f是核苷酸序列为seq id no.18的核酸分子；所述核酸探针g是核苷酸序列为seq id no.21的核酸分子；所述核酸探针h是核苷酸序列为seq id no.24的核酸分子；所述核酸探针i是核苷酸序列为seq id no.27的核酸分子；所述核酸探针j是核苷酸序列为seq id no.30的核酸分子；所述核酸探针k是核苷酸序列为seqid no.33的核酸分子。

41、上文中，探针a-k可具有标记物。所述标记物可为氨基修饰。具体可为探针a-k的5′端具有氨基修饰。所述5′端具有氨基修饰可为5′端第6位碳原子具有氨基修饰。所述氨基修饰可为“nh2”。

42、上文中，所述探针还可包括探针l。所述探针l是核苷酸序列为seq id no.36的核酸分子。

43、为了解决上述问题，本发明提供了下述应用。

44、上述试剂盒在下述任一中的应用；

45、e1)用于辅助检测或检测样本中是否含有常见致病菌；

46、e2)用于制备辅助检测或检测样本中是否含有常见致病菌的产品。

47、上文中，所述常见致病菌为沙门氏菌、大肠埃希氏菌o157:h7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌或产气荚膜梭菌中的至少一种。所述大肠埃希氏菌可为大肠埃希氏菌o157:h7。

48、为了解决上述问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定常见致病菌的方法。

49、所述方法包括使用如上任一所述引物组合物对待测样本进行体外核酸扩增，根据体外核酸扩增的特异性产物判断待测样本中是否存在见致病菌；

50、所述常见致病菌为沙门氏菌、大肠埃希氏菌o157:h7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌或产气荚膜梭菌中的一种或多种。

51、上文中，所述体外核酸扩增技术可为聚合酶链式反应(pcr)、链替代扩增(sda)、连接酶链式反应(lcr)和依赖核酸序列的扩增(nasba)、滚环核酸扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)、依赖解旋酶的等温扩增技术(hda)或qβ复制技术。本技术以聚合酶链式反应(pcr)为扩增手段进行特异性扩增。

52、上文中，所述体外核酸扩增的特异性产物可使用上述探针a、探针b、探针c、探针d、探针e、探针f、探针g、探针h、探针i、探针j、探针k和探针l来进行杂交。

53、所述探针a可以与引物对a扩增的产物进行特异性结合。所述探针b可以与引物对b扩增的产物进行特异性结合。所述探针c可以与引物对c扩增的产物进行特异性结合。所述探针d可以与引物对d扩增的产物进行特异性结合。所述探针e可以与引物对e扩增的产物进行特异性结合。所述探针f可以与引物对f扩增的产物进行特异性结合。所述探针g可以与引物对g扩增的产物进行特异性结合。所述探针h可以与引物对h扩增的产物进行特异性结合。所述探针i可以与引物对i扩增的产物进行特异性结合。所述探针j可以与引物对j扩增的产物进行特异性结合。所述探针k可以与引物对k扩增的产物进行特异性结合。所述探针l可以与引物对l扩增的产物进行特异性结合。

54、上述应用或方法可为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法可不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。

55、上述应用或方法可为非疾病治疗目的的应用或方法。上述应用或方法可不以使有生命的人体或者动物体恢复或获得健康或减少痛苦为直接目的。

56、所述待测样本可为环境样品(如空气)、饲料或饲料原料等。

57、有益效果

58、本发明公开了检测常见致病菌相关扩增引物、试剂盒及其应用。具体公开了鉴定或辅助鉴定常见致病菌的多重pcr引物组合物，所述引物组合物包括引物对a-k，述引物对a由a-f和a-r组成，所述a-f是核苷酸序列为seq id no.1的单链dna分子，a-r是核苷酸序列为seq id no.2的单链dna分子；所述引物对b由ab-f和b-r组成，所述b-f是核苷酸序列为seq id no.4的单链dna分子，b-r是核苷酸序列为seq id no.5的单链dna分子；所述引物对c由c-f和c-r组成，所述c-f是核苷酸序列为seq id no.7的单链dna分子，c-r是核苷酸序列为seq id no.8的单链dna分子；所述引物对d由d-f和d-r组成，所述d-f是核苷酸序列为seqid no.10的单链dna分子，d-r是核苷酸序列为seq idno.11的单链dna分子；所述引物对e由e-f和e-r组成，所述e-f是核苷酸序列为seq idno.13的单链dna分子，e-r是核苷酸序列为seq id no.14的单链dna分子；所述引物对f由f-f和f-r组成，所述f-f是核苷酸序列为seqid no.16的单链dna分子，f-r是核苷酸序列为seq id no.17的单链dna分子；所述引物对g由g-f和g-r组成，所述g-f是核苷酸序列为seq id no.19的单链dna分子，g-r是核苷酸序列为seq id no.20的单链dna分子；所述引物对h由h-f和h-r组成，所述h-f是核苷酸序列为seq id no.22的单链dna分子，h-r是核苷酸序列为seq id no.23的单链dna分子；所述引物对i由i-f和i-r组成，所述i-f是核苷酸序列为seq id no.25的单链dna分子，i-r是核苷酸序列为seq id no.26的单链dna分子；所述引物对j由j-f和j-r组成，所述j-f是核苷酸序列为seq id no.28的单链dna分子，j-r是核苷酸序列为seq id no.29的单链dna分子。所述引物对k由k-f和k-r组成，所述k-f是核苷酸序列为seq id no.31的单链dna分子，k-r是核苷酸序列为seq id no.32的单链dna分子。分别对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌o157:h7、志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、产气荚膜梭菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌bcet基因、蜡样芽孢杆菌entfm基因和蜡样芽孢杆菌gyrb基因进行特异性扩增。

59、进一步对引物对的使用量进行优化，建立了表6中的工作浓度，再配合相应的探针a-k，通过反向斑点杂交技术实现基因膜芯片法检测样本中的常见致病菌，结果显示，特异性强、检测限低和稳定性强，适用于各种样本的检测，所述各种样本可为饲料及其原料样本。