一种双碱基编辑系统及其应用

本发明涉及生物，尤其是涉及一种双碱基编辑系统及其应用。

背景技术：

1、碱基编辑技术(base editing)是一种由脱氨酶元件与人工核酸结合蛋白元件共同作用，从而对核酸碱基进行定点替换，以改变目标核酸序列的技术。人类遗传疾病约58％是由点突变或单核苷酸多态性(snp)引起，碱基编辑器(base editor，be)的出现为这类遗传疾病的治愈带来了新的希望。然而其应用不仅仅是在基因治疗，在疾病模型构建、基因功能研究、作物育种等各个领域也已显示出巨大的应用价值。

2、cbe、abe、cgbe等单碱基编辑器仅能催化单一类型碱基的替换，无法满足广泛的应用需求。有相关研究将abe系统与cbe系统联合起来得到双碱基编辑器acbe，其能在ncas核酸酶的缺刻酶变体基础上同时融合腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶，可实现在sgrna靶向位点的a-g和c-t的同时转换。但是上述单碱基编辑器、双碱基编辑器均只能实现碱基类型的单向变化，无法得到丰富的突变类型。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种双碱基编辑融合蛋白。

2、本发明还提供与上述双碱基编辑融合蛋白相关的生物材料。

3、本发明还提供包括上述双碱基编辑融合蛋白或生物材料的双碱基编辑系统。

4、本发明还提供上述双碱基编辑融合蛋白或生物材料或双碱基编辑系统在基因编辑或制备基因编辑产品中的应用。

5、本发明还提供一种非疾病诊断治疗目的的基因编辑方法。

6、本发明还提供一种基因编辑产品。

7、根据本发明的第一方面实施例的双碱基编辑融合蛋白，为a1)至a4)中的任一种，

8、a1)所述双碱基编辑融合蛋白自n端至c端依次包括：胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶、cas核酸酶的缺刻酶变体、次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶；

9、a2)所述双碱基编辑融合蛋白自n端至c端依次包括：尿嘧啶n-糖基化酶、胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶、cas核酸酶的缺刻酶变体、次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶；

10、a3)所述双碱基编辑融合蛋白自n端至c端依次包括：腺胞脱氨酶、cas核酸酶的缺刻酶变体、次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶；

11、a4)所述双碱基编辑融合蛋白自n端至c端依次包括：尿嘧啶n-糖基化酶、腺胞脱氨酶、cas核酸酶的缺刻酶变体、次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶。

12、cas核酸酶的缺刻酶变体用于切割靶序列，减少双链断裂，降低插入/缺失(indel)频率。

13、如果双碱基编辑融合蛋白各蛋白间的连接顺序发生变化，可能会影响活性编辑窗口的位置，窗口可能左右移动，从而导致相邻的双碱基(嘌呤和嘧啶)不能被同时编辑。

14、根据本发明的一些实施例，所述胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如seq id no.1第20-217位或seq id no.2第20-200位所示。

15、根据本发明的一些实施例，所述腺嘌呤脱氨酶的氨基酸序列如seq id no.1第234-399位或seq id no.2第216-579位所示。

16、根据本发明的一些实施例，所述腺胞脱氨酶的氨基酸序列如seq id no.3第20-185位或seq id no.4第20-185位所示。

17、根据本发明的一些实施例，所述cas核酸酶的缺刻酶变体的氨基酸序列如seq idno.1第432-1798位所示。

18、根据本发明的一些实施例，所述次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶的氨基酸序列如seq id no.1第1835-2131位所示。

19、根据本发明的一些实施例，所述尿嘧啶n-糖基化酶的氨基酸序列如seq id no.5第20-248位所示。

20、根据本发明的一些实施例，所述双碱基编辑融合蛋白还包括核定位序列、标签序列、连接肽(linker)中的至少一种。

21、根据本发明的一些实施例，所述核定位序列设于所述双碱基编辑融合蛋白的中间和/或n端或/和c端。所述核定位序列的数量为1条以上。优选为3条。所述核定位序列可设于胞嘧啶脱氨酶的n端、腺胞脱氨酶的n端、次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶的n端或次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶的c端。

22、根据本发明的一些实施例，所述核定位序列的氨基酸序列包括但不限于如krtadgsefespkkkrkv所示。

23、根据本发明的一些实施例，所述标签序列设于所述双碱基编辑融合蛋白的中间和/或n端或/和c端。

24、根据本发明的一些实施例，所述标签包括利于所述双碱基编辑融合蛋白的溶解、纯化和检测的标签中的至少一种。可以理解的是，本发明的双碱基编辑融合蛋白可以包含一个或多个标签；多个标签可以包含多个相同标签的组合，也可以为多个不同标签的组合。例如：利于所述双碱基编辑融合蛋白纯化的标签包括但不限于strep标签、his标签、gst标签、pelb信号序列或ompa信号序列；利于所述双碱基编辑融合蛋白检测的标签包括但不限于萤光素酶、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、hcred、dsred或青色荧光蛋白(cfp)。

25、根据本发明的一些实施例，所述连接肽为柔性连接肽。所述连接肽的氨基酸序列包括但不限于sgse tpgtsesatpes、sggssggssgsetpgtsesatpessggssggs、sggs、lggdsggsggsggs、egrgs lltcgdveenpgp、ggsggsggs或eaaakeaaakeaaak所示。

26、根据本发明的一些实施例，a1)中，所述连接肽可以设于腺嘌呤脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶、cas核酸酶的缺刻酶变体、次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶之间；a2)中，所述连接肽可以设于尿嘧啶n-糖基化酶、胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶、cas核酸酶的缺刻酶变体、次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶之间；a3)中，所述连接肽可以设于腺胞脱氨酶、cas核酸酶的缺刻酶变体、次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶之间；a4)中，所述连接肽可以设于尿嘧啶n-糖基化酶、腺胞脱氨酶、cas核酸酶的缺刻酶变体、次黄嘌呤切除蛋白n-甲基嘌呤dna糖基化酶之间。腺嘌呤脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶、cas核酸酶的缺刻酶变体之间可以通过xten linker连接。

27、根据本发明的第二方面实施例的与上述双碱基编辑融合蛋白相关的生物材料；所述生物材料包括b1)至b4)中的任一种；

28、b1)编码本发明第一方面实施例中所述双碱基编辑融合蛋白的核酸分子；

29、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

30、b3)含有b1)所述核酸分子或b2)所述表达盒的重组载体；

31、b4)含有b1)所述核酸分子、b2)所述表达盒或b3)所述重组载体的重组生物细胞。

32、根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述双碱基编辑融合蛋白的dna。该dna不但可包括启动所述双碱基编辑融合蛋白基因转录的启动子，还可包括终止所述双碱基编辑融合蛋白基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

33、根据本发明的一些实施例，载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。具体可以为pcmv载体。

34、根据本发明的一些实施例，所述重组载体可以为在载体的多克隆位点插入编码所述双碱基编辑融合蛋白的核酸分子得到的重组载体。

35、根据本发明的一些实施例，所述生物细胞包括原核细胞和真核细胞。所述原核细胞包括细菌或藻。所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。所述重组生物不包含生殖材料。

36、根据本发明的一些实施例，所述重组生物细胞为向生物细胞中导入b1)所述核酸分子、b2)所述表达盒或b3)所述重组载体，得到的重组生物细胞。

37、根据本发明的第三方面实施例的一种双碱基编辑系统，包括如上述第一方面实施例所述的双碱基编辑融合蛋白、如上述第二方面实施例所述的生物材料中的至少一种。

38、根据本发明的一些实施例，所述双碱基编辑系统还包括sgrna。所述sgrna用于引导所述双碱基编辑融合蛋白靶向靶标。

39、根据本发明的第四方面实施例的上述双碱基编辑融合蛋白或生物材料或双碱基编辑系统在基因编辑或制备基因编辑产品中的应用。

40、根据本发明的一些实施例，所述应用为非疾病诊断治疗的应用。

41、根据本发明的一些实施例，所述基因编辑用于实现碱基替换。具体包括a到g或c或t的替换、c到a或g或t的替换。

42、根据本发明的一些实施例，上述双碱基编辑融合蛋白或生物材料或双碱基编辑系统可用于研究基因功能或进行分子育种。

43、根据本发明的第五方面实施例的一种非疾病诊断治疗目的的基因编辑方法，包括以下步骤：

44、将上述双碱基编辑融合蛋白或生物材料、以及sgrna导入目标细胞中，实现基因编辑。

45、根据本发明的一些实施例，所述目标细胞包括哺乳动物细胞。具体包括但不限于hek293t细胞、a549细胞、hct116细胞或u2os细胞。

46、本发明至少具有如下有益效果：

47、实施例的双碱基编辑融合蛋白的基因编辑效率高，能够引入六种不同类型的碱基转化(实现a>g/c/t和c>t/g/a的转变)，产生丰富的突变产物，且突变相对均衡随机。尤其bd-de4能够完成全部碱基随机且任意替换，且双碱基编辑效率高，可以产生15种不同的双碱基突变组合。与agbe、a&c-bemax和类似对应物相比，实施例的双碱基编辑融合蛋白具有较低的indel频率，显著降低的cas9依赖性脱靶和cas9非依赖性脱靶效应，安全性高。实施例的双碱基编辑融合蛋白能够为构建高通量筛选平台提供帮助，不仅非常适用于高通量研究突变基因的功能，而且极大推动了分子育种的脚步。

48、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。