白桑来源的双功能糖基转移酶、基因、制备方法及应用

本发明属于基因工程与酶工程，具体涉及一种白桑来源的双功能糖基转移酶、基因、制备方法及应用。

背景技术：

1、苯丙素途径是广泛存在于植物体内的重要次生代谢途径，产生羟基肉桂酸、木质素、类黄酮、二苯乙烯、香豆素等代谢产物，在植物应对生物和非生物胁迫中发挥重要作用。此外，苯丙烷类化合物还具有重要的生物学活性和药用价值，具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌、改善糖和脂代谢、保护心脑血管系统等作用。糖基化修饰可以改变底物的理化性质和生物学活性，是苯丙烷类化合物最常见的修饰方法之一，进一步提高了苯丙烷类化合物的丰富程度，为药物筛选提供了巨大的化合物库。糖基化修饰也可以改变苯丙烷类化合物的亲疏水性、化学稳定性、亚细胞定位等特征，消除植物体内合成途径中的产物抑制，从而调节苯丙烷类化合物在体内的积累、转运和功能，参与植物的胁迫应答机制。

2、在亚洲，桑树长期以来被用作饲养家蚕的重要工业作物，并且被认为是具有降糖、抗肿瘤、抗炎、保健等功效的药食同源植物。桑树中富含苯丙烷类代谢物，包括类黄酮、二苯乙烯、桑辛素、酚酸以及它们的糖苷。这些化合物具有良好的生物活性，在桑树的生长发育和胁迫应答中发挥重要作用。

3、植物中的糖基化反应是由糖基转移酶(gt)催化的，它可以影响化合物的理化性质和生物活性。植物gt可以在底物的-oh、-cooh、-nh2、-sh基团以及特定底物的c原子上添加单个或多个糖基。然而，到目前为止，桑树中仅报道了几种gt。其中包括4种催化类黄酮3-oh糖基化的gt和催化山奈酚/槲皮素3-o-葡萄糖苷转化为山奈酚3-o-芦丁苷和芦丁的frgt。

4、因此，深入研究桑树中糖基转移酶对于解析内源性糖苷的生物合成，以及开发具有高催化价值的糖基转移酶资源具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中的不足，具体提供了一种白桑来源的双功能糖基转移酶、基因、制备方法及应用。该双功能糖基转移酶能够高效催化苯丙烷类化合物的糖基化反应以及酚酸类底物的葡萄糖酯化反应，可以用于制备具有生物活性的异黄酮、黄酮醇、查尔酮、桑辛素和香豆素等的糖苷类化合物。

2、为实现上述技术目的，本发明采用技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种白桑来源的双功能糖基转移酶，上述双功能糖基转移酶的氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

4、(a)具有seq id no.1所示的氨基酸序列；

5、(b)对seq id no.1所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代和/或缺失和/或添加而形成的具有相同活性的氨基酸序列；

6、(c)来源于桑属植物的具有与seq id no.1所示氨基酸序列同一性大于95％且具有相同活性的氨基酸序列。

7、第二方面，本发明提供一种白桑来源的双功能糖基转移酶基因，上述双功能糖基转移酶基因的核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

8、(a)具有seq id no.2所示的核苷酸序列；

9、(b)编码如seq id no.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；

10、(c)对seq id no.2的核苷酸序列进行一个或两个以上核苷酸取代和/或缺失和/或添加而得到的编码与第一方面所述双功能糖基转移酶活性相同的核苷酸序列；

11、(d)来源于桑属植物的具有与seq id no.2所示核苷酸序列同一性大于90％且编码与第一方面所述双功能糖基转移酶活性相同的核苷酸序列。

12、第三方面，本发明提供一种重组表达载体，通过在表达载体中插入第二方面所述的双功能糖基转移酶基因得到。

13、作为优选，上述表达载体为pgex-4t-1质粒或者植物表达载体pcambia1301。

14、第四方面，本发明提供一种含有第三方面所述的重组表达载体的重组基因工程菌。

15、作为优选，采用大肠杆菌rosetta(de3)作为宿主菌。

16、第五方面，本发明提供一种双功能糖基转移酶的制备方法，将第二方面所述的双功能糖基转移酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的双功能糖基转移酶。

17、作为优选，上述重组表达载体为大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体；宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

18、第六方面，本发明提供一种根据第五方面所述制备方法得到的双功能糖基转移酶的应用，将所述双功能糖基转移酶用于催化黄酮醇类、黄酮类、查尔酮类、异黄酮类、桑辛素类或香豆素类化合物糖基化反应；将所述双功能糖基转移酶用于制备黄酮醇糖苷类、黄酮糖苷类、查尔酮糖苷类、异黄酮糖苷类、桑辛素糖苷类或香豆素糖苷类化合物。

19、第七方面，本发明还提供一种根据第五方面制备得到的双功能糖基转移酶的应用，将所述双功能糖基转移酶用于催化酚酸类化合物葡萄糖酯化反应；将所述双功能糖基转移酶用于制备酚酸葡萄糖酯类化合物。

20、本发明的有益效果在于：

21、本发明从白桑cdna中扩增了maugt84r1编码基因的全长序列，构建了重组pgex-4t-1表达载体，转化大肠杆菌rosetta(de3)中诱导表达，并通过纯化得到了目的蛋白，即双功能糖基转移酶maugt84r1。该双功能糖基转移酶能够同时催化黄酮类、桑辛素类、香豆素类等化合物糖基化反应以及酚酸类化合物葡萄糖酯化反应。

22、体外酶活测试结果表明该双功能糖基转移酶具有广谱的催化活性，能够高效催化黄酮醇类、黄酮类、查尔酮类、异黄酮类、桑辛素类和香豆素类化合物的o-糖基化以及酚酸类化合物的葡萄糖酯化反应，可以用于制备具有生物活性的异黄酮、黄酮醇、查尔酮、桑辛素和香豆素等糖苷类化合物，具有较高的经济价值和广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种白桑来源的双功能糖基转移酶，其特征在于，所述双功能糖基转移酶的氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

2.一种白桑来源的双功能糖基转移酶基因，其特征在于，所述双功能糖基转移酶基因的核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

3.一种重组表达载体，其特征在于，通过在表达载体中插入权利要求2所述的双功能糖基转移酶基因得到。

4.根据权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于，所述表达载体为pgex-4t-1质粒或者植物表达载体pcambia1301。

5.一种含有权利要求3或4所述的重组表达载体的重组基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的重组基因工程菌，其特征在于，采用大肠杆菌rosetta(de3)作为宿主菌。

7.一种双功能糖基转移酶的制备方法，其特征在于，将权利要求2所述的双功能糖基转移酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的双功能糖基转移酶。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的重组表达载体为大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体；所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

9.一种根据权利要求7所述制备方法得到的双功能糖基转移酶的应用，其特征在于，将所述双功能糖基转移酶用于催化黄酮醇类、黄酮类、查尔酮类、异黄酮类、桑辛素类或香豆素类化合物糖基化反应；将所述双功能糖基转移酶用于制备黄酮醇糖苷类、黄酮糖苷类、查尔酮糖苷类、异黄酮糖苷类、桑辛素糖苷类或香豆素糖苷类化合物。

10.一种根据权利要求7所述制备方法得到的双功能糖基转移酶的应用，其特征在于，将所述双功能糖基转移酶用于催化酚酸类化合物葡萄糖酯化反应；将所述双功能糖基转移酶用于制备酚酸葡萄糖酯类化合物。

技术总结
本发明公开了一种白桑来源的双功能糖基转移酶、基因、制备方法及应用，属于基因工程与酶工程技术领域。本发明从白桑转录组数据中鉴定到一个主要在叶片中表达并且响应紫外胁迫和灰霉菌感染的糖基转移酶MaUGT84R1的转录本，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码双功能糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。原核表达和体外酶促反应结果表明该双功能糖基转移酶能够高效催化苯丙烷类化合物的糖基化反应以及酚酸类底物的葡萄糖酯化反应，可以用于具有生物活性的异黄酮、黄酮醇、查尔酮、桑辛素和香豆素等的糖苷类化合物的生物合成。

技术研发人员：刘胜志,朱玮,田景奎,胡阔,施润杰,赵瑜,李守信
受保护的技术使用者：中国科学院基础医学与肿瘤研究所（筹）
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29