新型的诊断肿瘤的标志物及其应用的制作方法

本发明属于疾病诊断标志物领域，更具体地，本发明涉及新型的诊断肿瘤的标志物及其应用。

背景技术：

1、表观遗传学(epigenomics)是研究基因在不发生dna序列改变的情况下，基因功能的可遗传的变化，并最终导致表型变化的一门学科。表观遗传学主要包括dna甲基化(dnamethylation)，组蛋白修饰(histone modification)，microrna水平变化等生化过程。dna甲基化是研究较为深入的表观遗传学机制，在包括诊断和治疗在内的肿瘤临床实践中有着应用前景。dna甲基化是指生物体内在dna甲基转移酶(dna methyltransferase，dmt)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(sam)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。dna甲基化可以发生在腺嘌呤的n-6位、胞嘧啶的n-4位、鸟嘌呤的n-7位或胞嘧啶的c-5位等。在哺乳动物中dna甲基化主要发生在5’-cpg-3’的c上，生成5-甲基胞嘧啶(5mc)。

2、在基因组中98％以上的cpg二核苷酸散在的分布位于具有转录依赖性的转座潜能的重复序列中。在正常细胞中，这些cpg处于高度甲基化/转录沉默的状态，而在肿瘤细胞中这些cpg发生了广泛的去甲基化，导致重复序列的转录、转座子的活化，基因组的高度不稳定性和原癌基因转录增强。余下的占总量2％左右的cpg密集地分布于较小的区域(cpg岛)。约40-50％的基因启动子区域或其附近存在cpg岛，暗示dna甲基化可能参与该类基因转录调控机制。

3、在肿瘤细胞中，一些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的cpg岛会发生高甲基化而导致基因的转录失活。受影响的基因包括dna修复基因，细胞周期控制基因和抗凋亡基因等抑癌基因。基因组dna经亚硫酸氢盐处理后，进行pcr(甲基化特异pcr，msp)检测可有效地确定受试dna片段的特定位点的甲基化状态。

4、人类基因组全序列尽管已经被人们所掌握，但是基因组序列纷繁复杂，哪些基因或哪些区段与疾病密切相关，仍然是目前本领域研究的重要课题。因此，有必要结合表观遗传学技术筛选有用于疾病诊断的新标志物。在本发明人的前期研究中，找到了一部分基于甲基化修饰的肿瘤标记物。但是，仍然有必要找到更多的新型肿瘤标志物，从而为肿瘤的诊断提供更多的途径。将来的肿瘤诊断必然需要多种标志物的联合运用，以提高诊断的准确性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供新型的诊断肿瘤的标志物及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供分离的人核酸或其转变而来的核酸在制备肿瘤筛查、诊断、检测或预后评估的试剂或试剂盒中的用途；其中，所述的人核酸包括(1)seq id no:1～16任一所示核苷酸序列的核酸或核酸组合，或含有所述序列中至少1个，如包括2～80个(可以是2～80的正整数的任一数)或3～77个(可以是3～77的正整数的任一数)修饰的cpg位点的核酸修饰的cpg位点的核酸或核酸组合；或(2)与(1)的核酸在序列上互补的核酸或核酸组合；其中，所述由人核酸转变而来的核酸为对应于(1)或(2)的核酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变。

3、在另一优选例中，与seq id no:1～16任一所示核苷酸序列的核酸互补的核酸分别是seq id no:17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107所示核苷酸序列的核酸。

4、在另一优选例中，所述肿瘤的样本包括：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。

5、在本发明的另一方面，提供一种分离的人核酸或核酸组合，包括：(1)seq id no:1～16任一所示核苷酸序列的核酸，或含有所述序列中至少1个修饰的cpg位点的核酸；或(2)与(1)的核酸在序列上互补的核酸。较佳地，所述“含有所述序列中至少1个修饰的cpg位点的核酸”具有约20～1392bp的长度，如长度30、40、50、60、70、80、100、150、200、300、500、1000bp。

6、在一个优选例中，所述修饰的cpg位点包括发生5-醛甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-甲基化修饰或5-羧甲基化修饰的cpg位点。

7、在另一个优选例中，所述分离的人核酸包括选自下组的核酸：seq id no:1～16任一所示核苷酸序列的核酸；seq id no:1中第122～175位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:2中第35～65位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:3中第52～65位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:4中第33～70位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:5中第273～291位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq idno:6中第2～43位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:7中第112～167位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:8中第16～46位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:9中第1～28位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:10中第27～40位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:11中第63～91位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:13中第1～39位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:14中第21～32位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:15中第497～536位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；或seq id no:16中第44～76位核苷酸序列或其互补的序列的核酸。

8、在本发明的另一方面，提供一种由前述所述分离的核酸或核酸组合转变而来的核酸或核酸组合，对应于前述分离的核酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变。

9、在另一优选例中，所述经转变而来的核酸或核酸组合由对应于前述分离的如seqidno:1～16的核酸或核酸组合，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理转变而来。较佳地，包括：如seq id no:18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108所示核苷酸序列的核酸或核酸片段，或如seq id no:19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109所示核苷酸序列的核酸或核酸片段；所述核酸片段包括至少1个(如包括2～80个，可以是2～80的正整数的任一数)修饰的cpg位点。较佳地，所述核酸片段具有约20～1392bp的长度，如长度30、40、50、60、70、80、100、150、200、300、500、1000bp。

10、在另一优选例中，所述的核酸的片段中包括：seq id no:18中第122～175位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:24中第35～65位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:30中第52～65位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:36中第33～70位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:42中第273～291位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:48中第2～43位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seqid no:54中第112～167位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:60中第16～46位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:66中第1～28位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:72中第27～40位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:78中第63～91位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:90中第1～39位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:96中第21～32位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；seq id no:102中第497～536位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；或seq id no:108中第44～76位核苷酸序列或其互补的序列的核酸。

11、在本发明的另一方面，提供一种试剂或试剂组合，其特异性检测靶序列的cpg位点修饰情况，所述的靶序列是权利要求3～8任一所述的核酸的全长或片段，其中包括至少1个(如包括2～80个，可以是2～80的正整数的任一数)修饰的cpg位点；较佳地，所述的试剂或试剂组合针对包含所述靶序列的基因序列，较佳地所述的基因序列包括基因panel或基因群组；较佳地，所述的试剂或试剂组合包括特异性检测seq id no:1～16中2～16条(如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15条)序列的试剂。

12、在另一优选例中，所述的试剂或试剂组合针对包含所述靶序列的基因序列(基于所述基因序列而设计)，较佳地所述的基因序列包括基因panel或基因群组。

13、在本发明的另一方面，提供一种制备试剂的方法，所述试剂用于肿瘤诊断、筛查、检测、分型或预后评估，所述方法包括：提供前面任一所述的分离的人核酸，以所述核酸全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的cpg位点修饰情况的检测试剂；其中，所述的靶序列中包括至少1个(如包括2～80个，可以是2～80的正整数的任一数)修饰的cpg位点；较佳地，所述的检测试剂包括但不限于：引物，探针，芯片或试纸。

14、在另一优选例中，，所述的检测试剂包括特异性检测seq id no:1～16中2～16条(如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16条)序列的试剂；较佳地，多种(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16条)所述的检测试剂被整合于芯片上。

15、在本发明的另一方面，提供一种用于进行肿瘤检测、筛查、分型、诊断或预后评估的试剂盒，该试剂盒中包括前面所述的试剂或试剂组合。

16、在另一优选例中，所述的试剂或试剂组合包括引物。

17、在另一优选例中，所述的引物包括：所述的引物包括选自下组的引物：seq id no:20和seq id no:21，或还包括seq id no:22；seq id no:26和seq id no:27，或还包括seqid no:28；seq id no:32和seq id no:33，或还包括seq id no:34；seq id no:38和seq idno:39，或还包括seq id no:40；seq id no:44和seq id no:45，或还包括seq id no:46；seq id no:50和seq id no:51，或还包括seq id no:52；seq id no:56和seq id no:57，或还包括seq id no:58；seq id no:62和seq id no:63，或还包括seq id no:64；seq id no:68和seq id no:69，或还包括seq id no:70；seq id no:74和seq id no:75，或还包括seqid no:76；seq id no:80和seq id no:81，或还包括seq id no:82；seq id no:86和seq idno:87，或还包括seq id no:88；seq id no:92和seq id no:93，或还包括seq id no:94；seq id no:98和seq id no:99，或还包括seq id no:100；seq id no:104和seq id no:105，或还包括seq id no:106；和/或seq id no:110和seq id no:111，或还包括seq idno:112。

18、在一个优选例中，所述的试剂盒中还可包括但不限于：dna纯化试剂，dna提取试剂，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐，pcr扩增试剂。

19、在其它优选例中，所述的试剂盒中还包括：用于标明检测操作步骤和结果判定标准的说明书。

20、在本发明的另一方面，提供所述的试剂或试剂组合的用途，用于制备肿瘤诊断、筛查、检测分型或预后评估的试剂盒。

21、在本发明的另一方面，提供检测待测样品的甲基化水平的方法，包括：提取待测样品的核酸；以及检测所提取的核酸中靶序列的cpg位点修饰情况，所述的靶序列是前述任一所述的经转变而来的核酸。

22、在另一优选例中，检测所提取的核酸中靶序列的cpg位点修饰情况的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qpcr法、数字pcr法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、dna富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、hplc法、massarray、甲基化特异pcr、或它们的组合；或seq id no:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。

23、在另一优选例中，所述检测所提取的核酸中靶序列的cpg位点修饰情况的方法包括：(i)对所提取的核酸进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；(ii)分析经(i)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。

24、在另一优选例中，步骤(ii)中，分析的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qpcr法、数字pcr法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、dna富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、hplc法、massarray、甲基化特异pcr(msp)、或它们的组合以及seq id no:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。并且，其它其他甲基化检测方法及未来新开发的甲基化检测方法也可被应用于本发明中。

25、在另一优选例中，所述的甲基化谱式的方法不是诊断性的方法，也即其不以直接获得疾病的诊断结果为目的。

26、在另一优选例中，所述检测样品的甲基化谱式的方法为体外方法。

27、在另一优选例中，步骤(ii)包括：(1)对(i)的产物进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；(2)分析经(1)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。

28、在另一优选例中，所述的甲基化谱式异常是指该核酸cpg中的c发生高度甲基化。

29、根据前面任一方面，所述肿瘤包括：血液系统肿瘤，消化系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，神经系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，其他系统肿瘤；较佳地，所述血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤癌；其他系统肿瘤如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤。

30、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。