用于人抗凝相关药物的基因位点检测的引物组、试剂及其方法与流程

本发明公开了一种引物组、试剂，具体地说，是一种指导人抗凝用药的引物组、试剂，涉及生物。

背景技术：

1、心脑血管疾病具有“四高一多”即“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高，并发症多”的特点。

2、传统医疗模式是“试误法”“千人一药”“万人一量”的经验用药模式，但药物疗效和不良反应呈个体化差异。相同的病症、相同的治疗药物、相同的剂量，有的人有效且无毒性、有的人无毒且无效、有的人有效但有毒，有的人无效且有毒。影响药物反应个体差异的原因有：性别、年龄、体重、身高、环境因素、病程、器官功能、并发症、遗传因素等，其中遗传因素是主要原因。遗传因素导致的个体间药物代谢与效应差异平均高达60％-95％。随着人类基因组学计划的完成，后基因组学的深入研究，药物基因组学迅速发展起来。

3、大量的临床数据也显示神经科开展个体化药物基因检测的必要性，药物基因组学的检测的常用方法有一代测序、二代测序、荧光定量pcr技术和飞行时间质谱检测技术。

4、一代测序，也称sanger法测序，主要基于桑格发明的双脱氧链终止法和pcr反应。缺点测序通量低，一个反应只能得到一条序列；成本略高，虽然单个反应价格低廉，但获得大量序列的成本很高；灵敏度较低，仅20％。

5、二代测序，特点是检测通量大，检测价格昂贵，操作繁琐，可检测未知的基因突变，生信分析复杂，目前主要适用于多基因位点的突变检测，在临床上主要用于肿瘤靶向用药基因突变检测，肿瘤易感性基因突变检测等。药物基因检测一般检测20-40个已知基因位点，如果二代测序技术用于药物基因检测样本，时间和人力成本会大大增加。

6、荧光定量pcr技术，检测通量低，检测基因位点一般在4-6个，若要检测多个位点，探针成本高，且具有一定的局限性。

7、上述方法均存在经济效益低，操作繁琐，灵敏度低，检测通量过大或者太低的问题。

8、因此，开发一种具有中高通量，成本低，检测速度快，操作简便，并且不需要复杂的生信分析的特点的检测方法显得尤为必要。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种用于人抗凝相关药物的基因位点检测的引物组，该引物具有高特异性、高灵敏性的特点，满足对目标位点特异性扩增和单碱基延伸的要求。

2、本发明的第二个目的是一种用于人抗凝相关药物的基因位点检测的试剂盒，该试剂盒具有使用方便、检测位点多、成本低的优点，满足对抗凝相关药物多基因多位点检测的要求。

3、本发明的第三个目的是一种用于人抗凝相关药物的基因位点检测的方法，该检测方法具有中高通量，成本低，检测速度快，操作简便。

4、为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

5、一种用于人抗凝相关药物的基因位点检测的引物组，包括引物组合1-引物组合18中的一种或多种的组合；

6、其中，引物组合1包括：seqidno.1-2所示的扩增引物和seqidno.37所示的延伸引物；

7、引物组合2包括：seqidno.3-4所示的扩增引物和seqidno.38所示的延伸引物；

8、引物组合3包括：seqidno.5-6所示的扩增引物和seqidno.39所示的延伸引物；

9、引物组合4包括：seqidno.7-8所示的扩增引物和seqidno.40所示的延伸引物；

10、引物组合5包括：seqidno.9-10所示的扩增引物和seqidno.41所示的延伸引物；

11、引物组合6包括：seqidno.11-12所示的扩增引物和seqidno.42所示的延伸引物；

12、引物组合7包括：seqidno.13-14所示的扩增引物和seqidno.43所示的延伸引物；

13、引物组合8包括：seqidno.15-16所示的扩增引物和seqidno.44所示的延伸引物；

14、引物组合9包括：seqidno.17-18所示的扩增引物和seqidno.45所示的延伸引物；

15、引物组合10包括：seqidno.19-20所示的扩增引物和seqidno.46所示的延伸引物；

16、引物组合11包括：seqidno.21-22所示的扩增引物和seqidno.47所示的延伸引物；

17、引物组合12包括：seqidno.23-24所示的扩增引物和seqidno.48所示的延伸引物；

18、引物组合13包括：seqidno.25-26所示的扩增引物和seqidno.49所示的延伸引物；

19、引物组合14包括：seqidno.27-28所示的扩增引物和seqidno.50所示的延伸引物；

20、引物组合15包括：seqidno.29-30所示的扩增引物和seqidno.51所示的延伸引物；

21、引物组合16包括：seqidno.31-32所示的扩增引物和seqidno.52所示的延伸引物；

22、引物组合17包括：seqidno.33-34所示的扩增引物和seqidno.53所示的延伸引物；

23、引物组合18包括：seqidno.35-36所示的扩增引物和seqidno.54所示的延伸引物。

24、其中，上述的引物组合1-18所检测的基因的扩增引物以及相应的snp位点信息见下表1。

25、表1

26、

27、

28、

29、其中，上述的引物组合1-18所检测的基因的延伸引物序列以及相应的snp位点信息见下表2。

30、表2

31、 seq id no. 检测位点 延伸引物序列(5’-3’) 37 rs730012 accttatctgtccc 38 rs6065 agcttgggttgggc 39 rs12248560 tcttctgtctcaaag 40 rs12041331 cagagagtaaggtga 41 rs1057910 cagaggtccaagatac 42 rs4986893 gagaaacttgccttacctggat 43 rs71647871 atggatccacggggg 44 rs8192935 caacaatatattaccataat 45 rs1045642 tcacaggaagat 46 rs9923231 agtataggcgagccaccgcacc 47 rs10306114 taactgagcaccctacatgctgg 48 rs1695 atagttggtgtaggagggaga 49 rs776746 ccgagctcttttgtttca 50 rs2231142 aggccggtgagaaaactta 51 rs13306198 ctcactttaccgaaga 52 rs62471956 accttccatggccccaaggacc 53 rs1801253 gcgcgcagcagcagtc 54 rs4244285 ggagtttgttaggttcc

32、进一步的，上述的用于人抗凝相关药物的基因位点检测的引物组，所述的人抗凝相关药物包括氯吡格雷、普拉格雷、华法林、醋硝香豆素、苯丙香豆素、阿司匹林、阿哌沙班、西洛他唑、达比加群、利伐沙班、艾多沙班、替格瑞洛中的一种或者多种，共检测12个药物15个基因18个位点；具体如表3所示。

33、表3

34、

35、

36、本发明提供的第二个技术方案是上述用于人抗凝相关药物的基因位点检测的试剂盒，包括第一个技术方案的引物组。

37、本发明提供的第三个技术方案是上述用于人抗凝相关药物的基因位点检测的方法，依次包括如下步骤：

38、(1)采用第一个技术方案中引物组中的扩增引物对样品进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

39、(2)采用sap酶混合液对步骤(1)的pcr扩增产物进行sap反应，得到消化反应产物；

40、(3)对步骤(2)消化反应产物进行ext延伸反应，得到延伸反应产物；

41、(4)对延伸反应产物进行样本脱盐后，采用飞行时间质谱检测系统对样本进行分析和检测。

42、进一步的，上述的用于人抗凝相关药物的基因位点检测的方法，在步骤(1)中，pcr扩增的采用的试剂及其用量如下：

43、超纯水0.8μl；

44、10×pcr缓冲液0.5μl；

45、mgcl2 0.4μl；

46、dntp混合液0.1μl；

47、引物组1-引物组18扩增引物的混合液1μl；

48、pcr酶0.2μl；

49、dna 2μl；

50、pcr扩增的反应程序为：95℃：2min；95℃：30s，56℃：30s，72℃：60s，重复43个循环；再在72℃保持5min，后冷却4℃∞。

51、进一步的，上述的用于人抗凝相关药物的基因位点检测的方法，各个扩增引物浓度见表4。

52、表4

53、

54、

55、进一步的，上述的用于人抗凝相关药物的基因位点检测的方法，sap反应采用的sap酶混合液包括下述组分及其含量：超纯水1.53μl；sap缓冲液0.17μl；sap酶0.3μl；反应程序如下：37℃，40分钟；然后升温85℃，5分钟，后冷却4℃∞。

56、进一步的，上述的用于人抗凝相关药物的基因位点检测的方法，延伸反应采用的试剂及其用量如下：

57、超纯水0.619μl；

58、iplex缓冲液0.2μl；

59、iplex terminationmix 0.2μl；

60、引物组1-引物组18的延伸引物混合液0.94μl；

61、iplex酶0.041μl；

62、延伸反应的程序为：94℃：40min；94℃：5s，52℃：5s，80℃：5s，52℃：5s，80℃：5s，52℃：5s，80℃：5s，52℃：5s，80℃：5s，52℃：5s，80℃：5s，重复40个循环；再在72℃保持3min，后冷却4℃∞。

63、进一步的，上述的用于人抗凝相关药物的基因位点检测的方法，延伸引物各个引物浓度见表5。

64、表5

65、

66、

67、进一步的，上述的用于人抗凝相关药物的基因位点检测的方法，52℃：5s，52℃：5s，52℃：5s，52℃：5s，52℃：5s，是在52℃：5s，80℃：5s，重复5个循环。

68、进一步的，上述的用于人抗凝相关药物的基因位点检测的方法，飞行时间质谱检测程序为：

69、1)使用assay editor导入assay design文件

70、2)打开软件

71、双击软件图标，输入密码，进入操作界面；

72、3)创建文件夹

73、在assay处右键选择project administrator，在name栏内输入project的名字，点击add；

74、4)导入assay

75、在对应的project处右键，选择import assay group designer format…，只勾选assay group，点击browse，选择assay group file，点击import；

76、5)创建plate

77、双击打开软件，选择plate editor，输入密码，进入软件界面；

78、6)为plate添加assay

79、在对应的project处右键，选择new plate，输入plate id，选择96wells，点击ok；

80、7)设置chip linker

81、双击chip linker按钮，输入密码，进入软件界面，在左侧选择设置好的plate，在右侧分别选择iplex，genotype+area，nanodispenser96to96，输入experiment name，芯片号chip barcode，点击add，再点击create；

82、8)在cpm的deck中放入mtp板和spectrochip

83、在系统中找到spectroacquire界面，点击chip prep module deck in/out，cpm的deck会自动弹出，放入芯片和mtp板。在spectroacquire中点击runsetup tab，在experiment name处选择对应的文档，设置完毕后点击软件上方的start chip prepmodule按钮开始实验。实验结束后点击remove old chips from ma4按钮将芯片返回cpm的deck内。

84、9)填写相关实验记录表；

85、10)下机数据拷贝

86、将分析文件和分析数据文件拷贝到u盘，转交给审核组审核。

87、与现有的方法相比，本发明具有以下优点及有益效果：

88、1.本发明提供的技术方案一次反应可同时检测10-40个snp位点，与传统检测技术pcr检测方法相比，无需荧光标记，耗材成本和样本用量低；具有中高通量，成本低的优点。

89、2、本发明提供的技术方案检测速度快和准确度高，操作简便，在24小时内即可出具结果报告，快速高效，通过正反双向设计引物，能达到快速有效检测；

90、3、本发明提供的技术方案，数据处理简单，不需要复杂的生信分析，全自动分析数据，赋予质谱获得数据质控状态及结果可信度分析，并完成基因分型报告。

91、4、本发明提供的技术方案通过检测报告查看患者的基因突变情况，患者服用哪种药物可以达到更好的疗效和最低的不良反应，从而达到预测药物的疗效、预测药物的剂量，规避药物的不良反应。