L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及l-肌肽制备方法即转运蛋白yjem的新用途。

背景技术：

1、l-肌肽是100多年前在乌克兰的charkow大学由gulewitsch和在分析肉类提取物时发现的[1]。它是一种天然存在的二肽，由β-丙氨酸和l-组氨酸组成，广泛分布在哺乳动物组织中，在心脏、骨骼肌以及大脑水平上发挥其生物活性并在其中高度聚集。一些无脊椎动物物种也含有肌肽。自该活性肽发现的一百多年来，已有大量的研究发现或者证明l-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗，由于其抗氧化的活性强，毒副作用低并具有多种生理活性,该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。

2、l-肌肽的化学合成已被广泛报道，成为目前生产l-肌肽的商业方式。化学合成方法虽然比较多，但主要有以下两种[2]：一是利用β-丙氨酸参与合成。其主要路线是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的l-组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到l-肌肽。该路线比较复杂，收率低，肽键形成过程中易消旋，影响产品纯度，并且溶剂消耗大，易造成环境污染；二是摒弃β-丙氨酸参与的反应。主要原理为l-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为l-肌肽。该路线相对简单，省去对不同基团的保护和脱保护的过程，避免消旋反应的发生，但是需要无水操作，要求比较严格。以上的路线随着工艺的差异，产品得率大约在60％-80％左右。

3、为了避免化学合成法在合成条件上所要求的保护基团的添加与脱除、反应温度变化剧烈、ph调整频繁、反应压力高、多相反应体系复杂、溶剂易燃易爆有毒、中间产物分离过程繁琐等诸多不利因素，近年来，国内外有研究者开始致力于利用酶或者细胞在温和的条件下合成l 肌肽。然而，通过生物方法获得的l-肌肽的收率远未达到工业化生产水平。因此亟需开发一种反应温和、产量高、操作简单的l-肌肽合成方法。

4、yjem是大肠杆菌中的一种转运蛋白，属于氨基酸-多胺-有机阳离子(apc)转运蛋白超家族，是gaba反向转运蛋白(gga)家族中的一个未特化成员。目前并没有关于yjem可以转运l-肌肽的相关现有技术的公开。

5、[1]guiotto a,calderan a,ruzza p,et al.carnosine and carnosine-relatedantioxidants:a review[j].curr med chem.2005；12(20):2293-315.

6、[2]吴长增,宋晓平.l-肌肽的合成与应用[j].许昌学院学报,2009(5):4.

技术实现思路

1、针对上述不足，本发明提供了一种l-肌肽制备方法，即转运蛋白yjem的新用途，经验证，yjem能够显著提高过表达重组菌株发酵生产l-肌肽的产量，本发明是yjem转运l-肌肽技术的首次公开。

2、本发明中yjem转运蛋白简称为yjem，其编码基因为yjem。

3、本发明的技术方案包括：

4、一方面，本发明提供了一种yjem转运蛋白或其编码基因在转运l-肌肽中的应用，所述的yjem的氨基酸序列如seq id no：1所示。

5、具体地，所述的转运蛋白用于促进l-肌肽向胞外转运。

6、具体地，所述的编码基因通过在表达l-肌肽的菌株中过表达发挥作用。

7、进一步具体地，所述的编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

8、进一步具体地，所述的过表达为构建过表达质粒。

9、优选地，所述的过表达质粒为pez07-yjem。

10、进一步具体地，所述的表达l-肌肽的菌株为基因工程菌株。

11、优选地，所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株。

12、进一步优选地，所述菌株的保藏编号为cgmcc no.27382。

13、另一方面，本发明提供了yjem转运蛋白或其编码基因在生产l-肌肽中的应用，所述yjem的氨基酸序列如seq id no：1所示。

14、具体地，所述应用为提高l-肌肽产量。

15、又一方面，本发明提供了一种yjem编码基因，所述yjem编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

16、又一方面，本发明提供了一种表达质粒的构建方法，包括以下步骤：

17、s1扩增yjem基因片段，获得目的基因；

18、s2将目的基因与酶切回收的载体片段进行克隆构建；

19、s3转化细胞，筛选阳性克隆，提取质粒验证，得到含有yjem转运蛋白的表达质粒。

20、优选地，步骤s1以大肠杆菌w3110基因组为模板，利用引物对扩增yjem基因片段。

21、优选地，步骤s1中所述的引物对为ptr166-f/ptr166-r；所述的引物ptr166-f的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述的引物ptr166-r的核苷酸序列如seq id no：4所示。

22、进一步优选地，所述步骤s1中所述的yjem基因核苷酸序列如seq id no：2所示，所述yjem的氨基酸序列如seq id no：1所示。

23、优选地，步骤s2中所述的载体为pez07载体。

24、进一步优选地，步骤s2中所述的目的基因yjem与pez07载体片段的纳摩尔比为1：2。

25、优选地，步骤s2中所述的酶为ncoi限制性内切酶和/或xhoi限制性内切酶。

26、优选地，步骤s3中所述转化细胞为加入感受态细胞，进行热击转化。

27、进一步优选地，步骤s3所述的感受态细胞选自tg1感受态细胞、dh5α感受态细胞、jm109感受态细胞中的一种或多种。

28、进一步优选地，步骤s3所述的感受态细胞为tg1感受态细胞。

29、优选地，步骤s3中所述的加入感受态细胞后，包括将其混匀放置42℃热击2min，冰浴2min的步骤。

30、优选地，步骤s3所述的壮观霉素浓度为80 150mg/l。

31、进一步优选地，步骤s3所述的壮观霉素浓度为100mg/ml。

32、又一方面，本发明提供了一种l-肌肽的生产方法，所述生产方法包括构建过表达yjem编码基因的基因工程菌株。

33、具体地，所述的yjem编码基因为seq id no：2，所述的基因工程菌株为保藏编号为cgmcc no.27382的大肠杆菌菌株。

34、由此，本发明同时提供了保藏编号为cgmcc no.27382的大肠杆菌菌株及其在生产l-肌肽中的应用，具体为提高l-肌肽产量中的应用。

35、所述菌株于2023年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为cgmcc no.27382，分类命名为大肠埃希氏菌。

36、具体地，所述菌株为l-肌肽基因工程菌株为shk20c/phd641。

37、具体地，所述基因工程菌株的出发菌株为大肠杆菌w3110(atcc 27325)。

38、进一步具体地，所述大肠杆菌w3110的基因型为f-mcramcrb in(rrnd-rrne)1lambda-。

39、具体地，所述菌株的制备包括以下步骤：大肠杆菌w3110为基础出发菌株，对l-肌肽的降解、摄取基因进行敲除，同时整合解除反馈抑制的l-肌肽合成操纵子，改良其反馈抑制和弱化调控等改造，获得l-肌肽基因工程菌株shk20c/phd641。

40、具体地，所述生产方法还包括构建重组菌株。

41、进一步具体地，所述重组菌株为上述构建得到的含有yjem转运蛋白的表达质粒转化l-肌肽基因工程菌株shk20c/phd641，分别得到含yjem转运蛋白的重组菌株。

42、优选地，所述重组菌株用于发酵生产l-肌肽，生产方法包括以下步骤：

43、(1)将重组菌株接入含相应抗生素的lb培养基进行培养，得到种子液；

44、(2)将步骤(1)的种子液转入发酵培养基中进行培养；

45、(3)加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，培养，得到含有l-肌肽的发酵液。

46、优选地，步骤(1)中所述的lb培养基为每1l包括：酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g。

47、优选地，步骤(2)中所述的发酵培养基为每1l包括：葡萄糖30g、5n-5倍的盐溶液200ml、tm3溶液1ml、柠檬酸铁10mg、七水硫酸镁246mg、氯化钙111mg和硫胺素1μg。

48、具体地，所述的5n-5倍的盐溶液包括：十二水合磷酸氢二钠75.6g/l、磷酸二氢钾15g/l、氯化钠2.5g/l和氯化铵25g/l。

49、具体地，所述的tm3溶液为每1l包括：四水氯化锌2.0g、六水氯化钙2.0g、两水钼酸钠2.0g、五水硫酸铜1.9g、硼酸0.5g和盐酸100ml。

50、优选地，所述的发酵过程中，还包括对上述的发酵培养基进行高压蒸汽灭菌步骤。

51、进一步优选地，所述的灭菌温度为121℃，时间20-30min。

52、优选地，步骤(3)中所述的iptg的终浓度为1mm。

53、优选地，所述l-肌肽的靠目测方法为高效液相色谱法(hplc)

54、具体地，所述的检测方法包括以下步骤：发酵液用灭菌水稀释至2倍，离心(1200rpm，1min)，过0.22μm滤膜，上清液用hplc检测。

55、hplc的参数如下：

56、采用ultimate aq-c18，4.6*250*5μm；

57、流动相a为：乙腈；

58、流动相b为：10mm辛烷磺酸钠+50mm磷酸二氢钾溶液，磷酸调ph至3.0；

59、流动相a：流动相b为15：85；

60、柱流量为1ml/min，柱温为30℃；

61、波长为210nm，进样量为5μl(稀释2倍后)；

62、检测时间为13min；

63、利用紫外检测器检测波长210nm，初始流动相的流速为1.0ml/min，发酵液的上样量5μl，柱温30℃。

64、本发明的有益效果为：

65、(1)本发明发现过表达yjem转运蛋白的重组菌株发酵生产的l-肌肽的产量明显高于对照组。

66、(2)目前并没有关于yjem可以转运l-肌肽的相关现有技术的公开，本专利是关于yjem转运l-肌肽的技术首次公开。

67、保藏说明

68、生物材料(菌株名称)：大肠埃希氏菌；

69、分类命名：大肠埃希氏菌escherichia coli；

70、保藏编号：cgmcc no.27382；

71、保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

72、保藏时间：2023年5月18日；

73、保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。