一种医用重组胶原蛋白及其发酵生产的方法和应用与流程

本发明涉及胶原蛋白生产，特别涉及一种医用重组胶原蛋白及其发酵生产的方法和应用。

背景技术：

1、胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，胶原蛋白种类较多，常见类型为ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型、ⅴ型和ⅺ型。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。通过各个技术的研发与突破，重组胶原蛋白从最初的护肤性产品，已经扩展到了医疗器械、组织工程、保健食品等领域。目前，重组胶原蛋白的应用范围在逐步扩大，也加大了对重组胶原蛋白和下游产品的市场需求。有研究数据显示，在2022年我国重组胶原蛋白的市场规模达到185亿元，同比增长71.3％，预计到2027年，重组胶原蛋白的市场规模将达到1083亿元。目前来看，我国的重组胶原蛋白行业具有良好的发展前景。

2、目前，现有的重组类胶原蛋白的发酵方法是通过毕赤酵母进行发酵而得，通常是加入甲醇进行诱导毕赤酵母表达，这样容易导致重组类胶原蛋白残留有甲醇，增加了该重组胶原蛋白下游产品的甲醇毒性。同时，现有技术对毕赤酵母诱导发酵获得的重组类胶原蛋白的抗氧化能力研究较少。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提出一种医用重组胶原蛋白及其发酵生产的方法和应用，解决上述问题。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明一方面提供一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，包括如下步骤：

4、s1取毕赤酵母gs115，以1～2％接种量接种至诱导培养基中，以27～28℃培养15～20h，得培养液；

5、s2取培养液，以1～2％接种量接种至扩大培养基中，以27～28℃、200～220rpm培养40～55h，得扩大培养液；

6、s3将扩大培养液以4～5％接种量接种至发酵培养基中，进行一次磁化诱导处理后，加入甲醇溶液，进行二次磁化诱导处理，以27～28℃培养20～25h，离心，取上清液，得含有重组胶原蛋白的上清液；

7、s4将含有重组胶原蛋白的上清液进行纯化除盐，得目标重组胶原蛋白。

8、进一步的方案是，两次磁化诱导处理包括：将发酵培养基置于磁场中，以磁场强度100～150mt进行磁化处理20～60min。

9、更进一步的方案是，一次磁化诱导处理的磁场强度为150mt，磁化处理的时间为20min，二次磁化诱导处理的磁场强度为100mt，磁化处理的时间为60min。

10、进一步的方案是，所述甲醇溶液的体积浓度为2～5％，每1l所述发酵培养基添加甲醇溶液的量为80～100ml。

11、进一步的方案是，每1l所述诱导培养基包括以下重量的组分：酵母粉0.8～1.2g、蛋白胨2.1～2.5g、葡萄糖2.1～2.5g、乙酰肌肽180～220μg和混合液0.8～1.2g；

12、每1l所述扩大培养基包括以下重量的组分：酵母粉0.8～1.2g、蛋白胨2.5～2.8g和葡萄糖3～4g；

13、每1l所述发酵培养基包括以下重量的组分：酵母粉0.8～1.2g、蛋白胨2.1～2.5g、葡萄糖2.1～2.5g和混合液0.8～1.2g；

14、所述混合液包括七水合硫酸亚铁0.8～1.2g/l、七水合硫酸锌0.2～2g/l、磷酸二氢钾1.5～2.5g/l、一水合硫酸锰0.2～0.5g/l和生物素0.05～0.08g/l。

15、进一步的方案是，步骤s3中，所述培养20～50h还包括发酵前段6～10h、发酵中段8～20h和发酵后段6～20h。

16、所述发酵前段6～10h，使发酵液的溶氧量保持25～30％；

17、所述发酵中段8～20h，使发酵液的溶氧量保持35～40％，开始以流速梯度的方式进行补料发酵，以初始速率5～6ml/h/l流加葡萄糖溶液，以速率5～6ml/h/l进行梯度递增，最终保持25～28ml/h/l的流加速率，同时流加乙酰肌肽；

18、所述发酵后段6～20h，将流速梯度的方式调整为恒速补料和出料的发酵模式，以速率12～15ml/h/l进行流加葡萄糖溶液，待发酵液中葡萄糖溶液的浓度>6g/l时，进行出料处理，出料处理后，以速率5～6ml/h/l进行流加葡萄糖溶液至发酵结束。

19、更进一步的方案是，所述发酵中段8.1～15h，速率每隔50～60min递增一次；所述发酵后段15.1～25h，出料的体积量为总发酵液体积量的10～12％。

20、更进一步的方案是，流加乙酰肌肽至发酵液中的乙酰肌肽的浓度为250～300μg/l。

21、本发明还提供上述的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法得到的医用重组胶原蛋白。

22、此外，本发明还进一步提供上述的医用重组胶原蛋白在医用化妆品中的应用，该医用重组胶原蛋白可作为清除dpph自由基的抗氧化剂，应用在医用化妆品中。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

24、1、本发明依次通过诱导培养基进行磁化诱导处理，扩大培养基的培育和发酵培养基的三段式培养发酵模式，结合流速梯度的补料方式与恒速补料和出料的发酵模式，并调控各步骤的发酵参数，纯化获得的重组胶原蛋白具有良好的抗氧化能力；该重组胶原蛋白可应用于表皮创面敷料，其不被表皮所吸收，符合ⅱ类医用敷料应用的要求，可作为医用重组胶原蛋白应用于医用敷料。

25、2、本发明通过在毕赤酵母的三段式培养发酵模式前，结合一次性甲醇进行磁化诱导处理，有助于提高毕赤酵母的发酵效率，通过发酵阶段流加乙酰肌肽可减少中间代谢物的毒性作用，提高生产率和细胞密度。

26、3、本发明对毕赤酵母的发酵诱导培养的工艺方法较为简单，通过控制发酵模式可达到较为理想的医用重组胶原蛋白，容错率极小，利于生产质量的控制。

技术特征：

1.一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，步骤s3中，两次磁化诱导处理包括：将发酵培养基置于磁场中，以磁场强度100～150mt进行磁化处理20～60min。

3.根据权利要求2的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，一次磁化诱导处理的磁场强度为150mt，磁化处理的时间为20min，二次磁化诱导处理的磁场强度为100mt，磁化处理的时间为60min。

4.根据权利要求1的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，所述甲醇溶液的体积浓度为2～5％，每1l所述发酵培养基添加甲醇溶液的量为80～100ml。

5.根据权利要求1的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，每1l所述诱导培养基包括以下重量的组分：酵母粉0.8～1.2g、蛋白胨2.1～2.5g、葡萄糖2.1～2.5g、乙酰肌肽180～220μg和混合液0.8～1.2g；

6.根据权利要求1的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，步骤s3中，所述培养20～50h还包括发酵前段6～10h、发酵中段8～20h和发酵后段6～20h的三段培养模式。

7.根据权利要求6的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，所述发酵中段8.1～15h，速率每隔50～60min递增一次；所述发酵后段15.1～25h，出料的体积量为总发酵液体积量的10～12％。

8.根据权利要求6的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法，其特征在于，流加乙酰肌肽至发酵液中的乙酰肌肽的浓度为250～300μg/l。

9.一种根据权利要求1～8任意一项的一种医用重组胶原蛋白的发酵生产方法得到的医用重组胶原蛋白。

10.一种根据权利要求9所述的医用重组胶原蛋白在医用化妆品中的应用，其特征在于，所述医用重组胶原蛋白作为清除dpph自由基的抗氧化剂的应用。

技术总结
本发明提出了一种医用重组胶原蛋白及其发酵生产的方法和应用，包括取毕赤酵母GS115，接种至诱导培养基中，进行磁化诱导处理后，加入甲醇溶液，进行二次磁化诱导处理，接种量接种至扩大培养基中，培养，将扩大培养液接种至发酵培养基中，培养，离心，取上清液，进行纯化除盐，得目标重组胶原蛋白。本发明纯化获得的重组胶原蛋白具有良好的抗氧化能力，其对DPPH自由基的清除率达到76％；该重组胶原蛋白可应用于表皮创面敷料，其不被表皮所吸收，符合Ⅱ类医用敷料应用的要求，可作为医用重组胶原蛋白应用于医用敷料。

技术研发人员：梁水莲,陈震,陆艳芳
受保护的技术使用者：广州岳铧医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19