一种塔宾曲霉及其发酵生产漆酶的方法

本发明涉及一种塔宾曲霉及其发酵生产漆酶的方法，涉及生物。

背景技术：

1、漆酶(laccase，ec1.10.3.2))是一种含铜的多酚氧化酶，利用氧分子作为电子受体可将多酚类、芳胺类、偶氮类化合物等多种底物转化为苯氧自由基和水，能够满足高效便捷和清洁环保的工业需求。因此，漆酶被广泛应用于服装行业、造纸行业、食品加工工业、生物传感器和生物检测等领域。漆酶最早从漆树渗出液中提取、分离而得，随后在细菌、真菌、高等植物和昆虫中也发现了漆酶的存在。

2、目前漆酶的提取纯化中，动物和植物漆酶的表达量低，提纯方法复杂，使得它们难以得到广泛应用。细菌漆酶相对真菌漆酶而言，其氧化还原电势较低，使其底物的利用范围受到限制，广泛的工业应用对真菌漆酶的需求不断增加，以低成本生产大量的酶是发酵制备的重要目标。而本发明研究和设计了一种曲霉属的塔宾曲霉发酵生产漆酶的方法，该菌株分离自普洱茶固态发酵中，具有使用安全、不产真菌毒素的特点，可广泛用于发酵食品和食品加工。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一株塔宾曲霉，保藏说明：

2、保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

3、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

4、保藏日期：2014年11月20日

5、保藏编号：cgmcc no：10022

6、分类命名：塔宾曲霉aspergillus tubingensis

7、本发明的另一目的在于提供一种塔宾曲霉发酵生产漆酶的方法，包括以下步骤：

8、(1)用接种环挑取保存在pda斜面培养基上的塔宾曲霉孢子，接种至pda平板培养基中，将培养基倒置，于37℃恒温培养箱培养4-5天后，用于后续实验。

9、(2)将步骤(1)中培养的塔宾曲霉孢子接种于由麸皮、葡萄糖、豆粕粉、nh4h2po4、k2hpo4、mgso4·7h2o、cacl2配制而成的培养基中进行培养。

10、(3)在培养基中加入产漆酶的诱导物，继续培养。

11、(4)培养结束后，收集培养液，经过滤，离心，硫酸铵沉淀，透析得到漆酶。

12、优选的，步骤(1)中采用三点接种法接种。

13、优选的，特征在于：步骤(2)中麸皮用量为60g/l、葡萄糖用量为60g/l、豆粕粉用量为10g/l、nh4h2po4用量为0.5g/l、k2hpo4用量为2g/l、mgso4·7h2o用量为0.5g/l、cacl2用量为0.075g/l。

14、优选的，步骤(2)中塔宾曲霉孢子接种量为103～109cfu/ml。

15、优选的，步骤(2)和步骤(3)所述培养条件为40℃，150rpm摇床培养。

16、优选的，步骤(3)所述诱导物为硫酸铜、edta、吐温-80中的一种，添加量为0.6mg/ml～1.0mg/ml。

17、优选的，步骤(3)中培养24h～72h时添加诱导物，加入诱导物后继续培养达到5～7天。

18、优选的，步骤(4)中所述过滤方式为滤纸过滤；离心条件为4℃、8000rpm离心20min，离心完取上清液；硫酸铵沉淀时当硫酸铵的饱和度至30％时，停止硫酸铵加入；用10kda膜透析进行透析，透析缓冲液为20mm的na2hpo4/nah2po4磷酸盐缓冲液，ph＝6。

19、本发明的有益效果

20、(1)本发明首次采用了塔宾曲霉液态发酵生产漆酶，液态发酵具有易实现自动化连续生产，生产过程易控制，生产规模大等优点。

21、(2)本发明的塔宾曲霉菌株分离自普洱茶固态发酵中，具有使用安全、不产真菌毒素的特点。

22、(4)本发明所提供的培养基配方有助于塔宾曲霉产生漆酶。

23、(3)本发明所述方法为漆酶的生产开辟了新途径。

技术特征：

1.一种塔宾曲霉，其特征在于：所述述塔宾曲霉菌的保藏号为：

2.权利要求1所述塔宾曲霉生产发酵漆酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述塔宾曲霉发酵生产漆酶的方法，其特征在于：步骤(1)中采用三点接种法接种。

4.根据权利要求2所述塔宾曲霉发酵生产漆酶的方法，其特征在于：步骤(2)中麸皮用量为50～70g/l、葡萄糖用量为50～70g/l、豆粕粉用量为5～15g/l、nh4h2po4用量为0.5～1g/l、k2hpo4用量为1～3g/l、mgso4·7h2o用量为0.5～1g/l、cacl2用量为0.075g/l。

5.根据权利要求2所述塔宾曲霉发酵生产漆酶的方法，其特征在于：步骤(2)中塔宾曲霉孢子接种量为103～109cfu/ml。

6.根据权利要求2所述塔宾曲霉发酵生产漆酶的方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)所述培养条件为40℃，150rpm摇床培养。

7.根据权利要求2所述塔宾曲霉发酵生产漆酶的方法，其特征在于：步骤(3)所述诱导物为硫酸铜、edta、吐温-80中的一种，添加量为0.6mg/ml～1.0mg/ml。

8.根据权利要求2所述塔宾曲霉发酵生产漆酶的方法，其特征在于：步骤(3)中培养24h～72h时添加诱导物，加入诱导物后继续培养达到5～7天。

9.根据权利要求2所述塔宾曲霉发酵生产漆酶的方法，其特征在于：步骤(4)中所述过滤方式为滤纸过滤；离心条件为4℃、8000rpm离心20min，离心完取上清液；硫酸铵沉淀时当硫酸铵的饱和度至30％时，停止硫酸铵加入；用10kda膜透析进行透析，透析缓冲液为20mm的na2hpo4/nah2po4磷酸盐缓冲液，ph＝6。

技术总结
本发明公开了一种塔宾曲霉及其发酵生产漆酶的方法，包括以下步骤：将从普洱茶中分离得到的塔宾曲霉接种于培养基中，发酵培养后获得含漆酶发酵液，分离含漆酶发酵液获得漆酶。所述培养基组成为麸皮、葡萄糖、豆粕粉、NH4H2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2，在培养过程中加入诱导物，继续培养，培养结束后的培养液通过滤纸过滤菌丝体，离心，取上清液，上清液经过吐温‑80分级沉淀、离心、膜透析脱盐后得到漆酶酶液，由该方法培养得到的漆酶的酶活性达到22.60U/mL。本发明采用自制培养基首次实现了塔宾曲霉液态发酵生产漆酶，液态发酵具有易实现自动化连续生产，生产过程易控制，生产规模大等优点。

技术研发人员：王秋萍,龚加顺,王薇,白健
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22