一种耐热酿酒酵母菌株及其应用

本发明属于微生物发酵领域，涉及一种耐热酿酒酵母菌株及其应用，尤其涉及一种耐热酿酒酵母菌及其生产生物乙醇的方法。

背景技术：

1、生物乙醇是目前全球最主要的液体可再生能源，也是公认的汽油最佳替代燃密不可分。2017年全球生物乙醇产量达7942万吨，占总生物液体燃料产量的75%。生物乙醇通常采用酿酒酵母发酵，酿酒酵母最适生长温度为30-32℃，但在实际生产中局部最高可达37-40℃，高温会大幅降低菌株的生产效率。目前工业生产中常用循环水冷却对发酵罐控温，但生产过程中情况复杂多变，不排除局部环境出现过热的情况，难免会影响生产效率。

2、此外，绝大部分的工业微生物，尤其是模式工业微生物酿酒酵母对温度都较敏感，发酵中后期需要消耗大量的冷却水来控制温度。在微生物发酵和代谢中后期如果不进行冷水控温，发酵体系的温度可以上升到50℃以上。事实上，微生物发酵过程控制及其设备是一类高能耗的过程和装置。目前，大规模生产中单台发酵罐的体积已达到300～400立方米，发酵过程中产生的热量必须通过低温循环水带走。据统计，目前我国的发酵装置中，动力费用约占发酵液成本的25％～40％, 其中常用的冷却过程每立方米发酵液每小时需要的电功率为1.6～2.8千瓦时。计算发现，如果发酵培养控制温度每升高5℃，冷却水消耗将减少15%。以年产万吨发酵产品的企业计算，仅冷却用电可减少172.8万千瓦时。此外，发酵温度的提高不仅可以减少发酵体系的污染，也可以使微生物的发酵周期缩短，这样就会大大降低生产成本。中粮集团有限公司统计表明，若发酵温度升高1℃，中粮集团一年就可以降低近1亿的成本。随着水、电资源的日趋紧张，煤炭和石油等燃料价格不断上升，也造成了发酵成本的大量增加。因此，提高微生物细胞的耐热性对于提高生物反应效率、降低控制过程能耗和生产成本至关重要。

3、因此，需要一种能更加耐热的工业酒精发酵菌株。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种耐热酿酒酵母菌株及其应用。该耐热酵母菌株在40℃下，仍然能维持较高的活性。本发明以连续发酵数代的酿酒酵母为出发菌株，通过紫外+常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma，artp)诱变的方法，经两轮诱变、液化醪摇瓶发酵验证、工业物料小试验证后获得耐高温的酿酒酵母菌。

2、本发明一方面提供了一种耐热酿酒酵母菌株，菌株代号为xk-01，分类命名为：酿酒酵母 saccharomyces cerevisiae 保藏编号为cgmcc no. 28621，保藏时间为2023.10.12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

3、保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

4、本发明另一方面还提供了一种用上述菌株生产乙醇的方法，包括如下步骤：

5、1）将菌株xk-01接种于种子培养基中扩繁得到种子培养物，扩繁至酵母数为0.15亿/ml；

6、2）取种子培养物离心，去上清液后，再用无菌0.01m pbs洗1次，再用无菌0.01mpbs悬浮制得种子悬液，接种入液化醪中发酵72 h。

7、作为优选，所述种子培养基为ypd液体培养基，含有2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉，以质量分数计。

8、作为优选，所述步骤2）中种子培养物的接种量为液化醪的16 v/v%。

9、作为优选，所述液化醪通过如下方法制备：

10、取250g粉碎玉米，加750g水，然后加入1 ml浓度为1.625 g/50 ml的淀粉酶水溶液；在85℃下300 rpm搅拌0.5 h，然后将搅拌速度降为160 rpm；搅拌2 h后，迅速放入冰水浴中搅拌降温至32℃。

11、作为优选，所述步骤2）中液化醪的发酵条件为前12 h，32℃；12-72 h，温度最高不超过40℃。

12、在一些特殊情况下，本发明的耐热酿酒酵母菌株通过发酵生产工业乙醇可以在不严格控温的条件下进行。

13、为优选，其特征在于，所述种子悬液的体积为所取种子培养物体积的1/20。

14、本发明另一方面还提供了一种上述的耐热酿酒酵母菌株用于发酵生产乙醇的应用。

15、本发明另一方面还提供了一种使用上述耐热酿酒酵母菌株制备酵母溶胞物的方法，包括以下步骤：

16、1）将酵母菌种接种至ypd液体培养基发酵培养，并控制最高温度40℃，发酵24 h；

17、2）将发酵后的产物进行一次离心，转速为8000 r/min，离心2 min；

18、3）弃去上清液，用0.01mpbs洗涤后，进行二次离心，转速为8000 r/min，离心2min；

19、4）使用珠打或高压匀浆破碎的方法破碎细胞，过滤除菌，制得所述耐热酵母溶胞物。

20、本发明另一方面还提供了一种如上述方法制备的酵母溶胞物在制备化妆品中的应用。

21、在某些具体实施方案中，本发明菌株采用如下方法进行诱变：

22、诱变条件： artp以氮气作为等离子体的工作气体，分别将100μl制备的菌悬液滴于无菌金属槽内中心位置，进行等离子体照射，同时在仪器中开启紫外诱变。酵母菌株诱变后接种于ypd固体培养基中，40℃高温筛选，从第一轮诱变中选取生长及发酵性能较好的菌株进行第二轮诱变。

23、本发明具有以下有益效果：

24、本发明采用液化醪小试验证本发明的耐热酿酒酵母菌株的性能。与对照菌株相比，本发明所述酿酒酵母菌菌株乙醇产量和细胞存活率均明显提高，色谱总糖含量、滴定过滤总糖含量以及甘油含量则明显降低，即本发明所述酿酒酵母菌菌株可在最高40℃的条件下保证燃料乙醇生产的稳定性，提高乙醇生产效率，降低生产成本，适合于工业液体燃料乙醇的大规模生产。诱变选育的酿酒酵母xk-01发酵生长适宜温度40℃，具有一定的鲁棒性，产酒酒份15.26％ (v/v)，残总糖2.83 (g/100ml)，具有良好的发酵性能。

技术特征：

1.一种耐热酿酒酵母菌株，其特征在于，菌株代号为xk-01，保藏编号为cgmcc no.28621，保藏时间为2023.10.12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种用权利要求1所述菌株生产乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为ypd液体培养基，含有2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉，以质量分数计。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中种子培养物的接种量为液化醪的16 v/v%。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液化醪通过如下方法制备：

6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中液化醪的发酵条件为前12 h，32℃；12-72 h，温度最高不超过40℃。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子悬液的体积为所取种子培养物体积的1/20。

8.一种如权利要求1所述的耐热酿酒酵母菌株用于发酵生产乙醇的应用。

9.一种使用如权利要求1所述耐热酿酒酵母菌株制备酵母溶胞物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.一种如权利要求9所述方法制备的酵母溶胞物在制备化妆品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种耐热酿酒酵母菌株及其应用。该耐热酿酒酵母菌株XK‑01，保藏号为CGMCC No.28621。本发明所述耐耐热酿酒酵母菌株在40℃下仍具有较高的发酵效率，能满足工业生产需要。与对照菌株相比，本发明所述酿酒酵母菌菌株乙醇产量和细胞存活率均明显提高，可在40℃的条件下保证生物乙醇生产的稳定性，提高乙醇生产效率，降低生产成本，适合于工业乙醇的大规模生产。此外，本发明还公开了一种耐热酿酒酵母菌株用于制备工业乙醇或制备化妆品的应用。

技术研发人员：许可,武秋颖,李玉洁,王双双,张运峰
受保护的技术使用者：唐山师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22