馥芳艾纳香中咖啡酰奎宁酸的提取和检测方法

本发明属于生物提取，具体涉及馥芳艾纳香中咖啡酰奎宁酸的提取和检测方法。

背景技术：

1、酚类化合物是植物在生长过程中产生的次生代谢产物。它们在蔬菜、水果和药用植物中丰富存在。酚类化合物具有多种结构和生物活性。它们可以充当抗氧化剂、抗微生物、抗癌剂、抗衰老剂、抗炎剂和抗高血压剂。因此，植物酚类化合物在食品和药物领域有广泛的应用。咖啡酰奎宁酸(cqas)是酚类化合物的一个重要组成部分，来源于苯丙素生物合成途径。这些化合物由奎宁酸与一个到四个咖啡酸基团酰化而成，共有15种可能的组合，包括四种单咖啡酰奎宁酸，六种双咖啡酰奎宁酸，四种三咖啡酰奎宁酸和一种四咖啡酰奎宁酸。咖啡酰奎宁酸具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒、抗阿尔茨海默病和神经保护活性。咖啡酰奎宁酸通常通过植物性食品(如水果、蔬菜和咖啡饮料)摄入，由于其多样的生物活性，咖啡酰奎宁酸越来越引起人们的关注，它们具有开发为新药物的潜力。

2、尽管对咖啡酰奎宁酸的定性和定量方法已有一些研究，但咖啡酰奎宁酸同分异构体的表征和准确的定量分析仍然具有较大挑战性。这主要归因于几个因素，包括存在具有相似物化性质的多个同分异构体、商业标准的缺乏，以及在样品处理过程中咖啡酰奎宁酸的降解和转化。这些挑战阻碍了咖啡酰奎宁酸同分异构体的准确表征和咖啡酰奎宁酸的综合表征方法的开发。为了克服这些挑战并推动对咖啡酰奎宁酸的研究，包括食品添加剂、保健产品和药品等各个领域，有必要进一步研究用于咖啡酰奎宁酸的提取方法以及定性和定量分析技术。

3、酚类化合物主要通过有机溶剂或物理辅助技术从植物基质中提取。然而，有机溶剂提取具有高挥发性、毒性、易燃性和低生物降解性等缺点。低共熔溶剂(dess)是一种新型的环保溶剂，通常由氢键供体(hbd)和氢键受体(hba)组成。dess的熔点低于任何组分的熔点，因此它们可以在室温下以液体形式稳定存在。与有机溶剂相比，dess易于合成、成本低廉、稳定、不挥发、可生物降解且环保等特点。近年来，dess引起了更多的关注，并广泛应用于天然产物提取。

4、馥芳艾纳香(blumea aromatica dc.)是艾纳香属的多年生草本植物，在中国西南和东南亚地区生长。在中医药中被称为“山风”，广泛用于治疗风湿病、关节痛和湿疹等疾病。尽管已经认识到它的潜力，但对馥芳艾纳香的化学成分和生物活性仍知之甚少。值得注意的是，在以前的研究中，从馥芳艾纳香中分离的化合物主要为labdane和bisnor二萜类化合物，这些化合物展示的多样生物活性，包括抗炎、免疫抑制和腺苷酸环化酶活化性质。然而，目前还没有关于馥芳艾纳香中咖啡酰奎宁酸的提取方法和含量测定的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于，提供一种从馥芳艾纳香中提取咖啡酰奎宁酸的方法。本发明研究显示，使用七种dess从馥芳艾纳香中提取九种咖啡酰奎宁酸时与三种传统溶剂相比，具有良好的提取效率，并且针对特定咖啡酰奎宁酸衍生物，使用特定的dess能获得更高的提取效率。

2、本发明的目的之二在于，提供一种馥芳艾纳香中咖啡酰奎宁酸的检测方法。本发明开发了一种uplc-q-orbitrap hrms方法，能同时测定馥芳艾纳香中九种咖啡酰奎宁酸的含量；方法学研究表明，该方法具有出色的精密度、准确度、重复性和稳定性。

3、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种从馥芳艾纳香中提取咖啡酰奎宁酸的方法，包括以下步骤：将馥芳艾纳香植株干燥后压碎，过筛，取馥芳艾纳香粉末，加入低共熔溶剂，振荡混合后进行超声处理，冷却至室温后，离心，取上清液，即得；所述的低共熔溶剂是由氯化胆碱与乳酸、乙酸、乙二醇、尿素、甘油、1,4-丁二醇、草酸中的任意一种复配组成。

5、优选的，所述的咖啡酰奎宁酸包括绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸、1,3-o-二咖啡酰奎宁酸、1,4-o-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸a、异绿原酸b和异绿原酸c。

6、优选的，所述的低共熔溶剂中氯化胆碱与乳酸、乙酸、乙二醇、尿素、甘油、1,4-丁二醇或草酸复配的摩尔比为1:2～3。

7、优选的，所述的低共熔溶剂是由氯化胆碱与乙二醇或1,4-丁二醇按摩尔比1:3复配组成。

8、优选的，所述的超声处理的条件为功率100～800w，频率40khz，温度30～80℃，时间10～60min。

9、优选的，所述的馥芳艾纳香粉末与低共熔溶剂混合的料液比为1g:10～200ml。

10、一种馥芳艾纳香中咖啡酰奎宁酸的检测方法，包括以下步骤：

11、(1)制备标准溶液：分别准确称取绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸、1,3-o-二咖啡酰奎宁酸、1,4-o-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸a、异绿原酸b和异绿原酸c的对照品，以甲醇溶液为溶剂，配制不同浓度的混合标准溶液；

12、(2)制备待测样品溶液：将按照权利要求1所述的方法提取获得的上清液与甲醇溶液涡旋混匀，过滤，得到待测样品溶液；

13、(3)检测：采用uplc-q-orbitrap hrms分别对混合标准溶液和待测样品溶液进行检测，以对照品的浓度为横坐标，定量用子离子的质量色谱图峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线，对待测样品溶液中不同咖啡酰奎宁的成分进行检测。

14、优选的，所述的甲醇溶液的浓度为质量分数50％。

15、优选的，所述的过滤是使用0.22μm的微孔膜过滤。

16、优选的，所述的uplc-q-orbitrap hrms的色谱条件为：

17、色谱柱：thermo fisher scientific bremen hypersill gold aq(100mm×2.1mm,1.9μm)；流动相a：含体积分数0.1％甲酸的乙腈溶液，流动相b：含体积分数0.1％甲酸的水溶液；梯度洗脱：0～15min，b 97％；15～20min，b 97％～96％；20～25min，b 96％～90％；25～50min，b 90％～87％；50～54min，b 87％～5％；流速为0.3ml/min，进样量为2μl；柱温为42℃，检测波长为330nm，使用dad进行检测。

18、质谱条件为：采用负离子扫描模式，检测条件如下：hesi离子源，电喷雾电压为3.5kv，毛细管温度为325℃，辅助气体温度为300℃；质谱扫描范围为m/z 200～600；氮气用于鞘气、辅助气体和吹扫气体；鞘气流速为50l/min，辅助气体流速为8l/min，吹扫气体流速为1l/min；分辨率为60000。

19、本发明具有以下有益效果：

20、1.本发明利用七种低共熔溶剂作为提取剂，与三种传统溶剂(乙醇、甲醇、水)相比，从馥芳艾纳香中提取特定的咖啡酰奎宁酸表现出显著优势。其中，des-6(氯化胆碱：1,4-丁二醇)是提取3-o-咖啡酰奎宁酸和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸的最佳溶剂，浓度分别为4.71±0.31和2.28±0.19mg/g。des-7(氯化胆碱：草酸)是提取4-o-咖啡酰奎宁酸的最佳溶剂，浓度为2.05±0.05mg/g。des-5(氯化胆碱：甘油)是提取5-o-咖啡酰奎宁酸，1,3-o-二咖啡酰奎宁酸，1,4-o-二咖啡酰奎宁酸和3,4-o-二咖啡酰奎宁酸的最佳溶剂，浓度分别为1.70±0.14，2.17±0.04，1.39±0.14和2.30±0.06mg/g。des-2(氯化胆碱：乙酸)是提取1,5-o-二咖啡酰奎宁酸和3,5-o-二咖啡酰奎宁酸的最佳溶剂，浓度分别为7.60±0.38和5.70±0.23mg/g。

21、2.本发明对来自馥芳艾纳香的十种溶剂提取物进行了dpph和abts自由基清除实验以及还原能力测定，结果显示：des提取物表现出出色的抗氧化活性，超越了传统溶剂的抗氧化活性，其中，des-3(氯化胆碱：乙二醇)提取物表现出最突出的清除自由基活性，dpph和abts自由基的ic50值分别为197.36±1.05和14.86±3.33μg/ml。des-6(氯化胆碱：1,4-丁二醇)提取物显示出最高的还原能力。此外，相关性分析显示酚酸含量与抗氧化活性之间存在正相关关系，3-o-咖啡酰奎宁酸和5-o-咖啡酰奎宁酸显示出显著的相关性(p值分别小于0.001和0.05)。此外，4-o-咖啡酰奎宁酸、1,3-o-二咖啡酰奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰奎宁酸和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸表现出特定且相关的抗氧化活性。

22、3.本发明开发了一种uplc-q-orbitrap hrms方法，能同时测定馥芳艾纳香中九种咖啡酰奎宁酸的含量。方法学研究表明，该方法具有出色的精密度、准确度、重复性和稳定性。分析确定了在本研究中确定的九种咖啡酰奎宁酸中的两组异构体：三个单咖啡酰奎宁酸和六个双咖啡酰奎宁酸。尽管每组中的成分在结构上存在极小的差异，但它们在取代基的位置上有所不同。馥芳艾纳香中九种咖啡酰奎宁酸的含量存在显著差异，存在微量成分。因此，同时确定这九种咖啡酰奎宁酸的含量构成了一个相当大的挑战。在本发明中，通过不断优化色谱分离条件并利用uplc-q-orbitrap hrms技术的分析优势，我们实现了对九种咖啡酰奎宁酸的同时定量分析。本发明研究为类似化合物的分析技术的研究和探索提供了有价值的参考。