一种基于荧光PCR实时检测短颌鲚的引物、探针及试剂盒

本发明涉及于分子生物学，具体涉及一种基于荧光pcr实时检测短颌鲚的引物、探针及试剂盒。

背景技术：

1、短颌鲚(曾被命名为coilia brachygnathus)隶属于鲱形目(clupeiformes)、鳀科(engraulidae)、鲚属(coilia)，《中国动物志》将短颌鲚归为刀鲚，认为它是刀鲚的淡水定居种，主要分布在长江及淮河流域的中、下游，及与长江流域相通的淡水湖泊，例如鄱阳湖和洞庭湖。随着近年来的野外调查发现，短颌鲚在长江上游三峡库区出现频率逐渐升高。在三峡库区历史研究表明，短颌鲚具有适应力强、性成熟早和繁殖率高的生物学特性，以江河中浮游动物、小鱼虾和鱼苗为食，又可作为大型肉食性鱼类的饵料，在分布水域的食物链中占有重要地位。现如今，国家施行的长江十年禁渔计划已全面开展，在禁渔期间，库区内外来物种和土著物种之间的相互影响情况尚未可知，最终的资源恢复情况也难以预测。短颌鲚在三峡库区的种群规模很可能会不断扩大，最终威胁到三峡水库原有的生物多样性。因此，建立短颌鲚的快速准确鉴定方法是十分必要的。现有技术中通常采用进行普通pcr扩增反应后，送至生物公司进行测序，将得到的测序结果在ncbi基因库中进行比对的方法，这种方式在ncbi基因库比对时，针对同属不同种的物种鉴定较为模糊，存在误判的可能。同时，基因测序耗时较长，大大增加了物种鉴定的时长。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种基于荧光pcr实时检测短颌鲚的引物、探针及试剂盒。

2、为达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

3、提供一种基于荧光pcr实时检测短颌鲚的引物和探针，其引物和探针包括上游引物hf2、下游引物hr2和探针h-mgb2，其核苷酸序列分别如下所示：

4、hf2：acgcctaccagaacccacg；

5、hr2：tctgaggcaccgccaagtc；

6、h-mgb6：5’-ccagccataaaccttgatactttca-3’，其中5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。

7、进一步的，扩增反应时，上游引物hf2、下游引物hr2和探针h-mgb2的摩尔比为：1∶1∶2。

8、一种采用上述引物和探针的短颌鲚检测试剂盒，所述试剂盒包含上游引物hf2、下游引物hr2和探针h-mgb2。

9、进一步的，还包括以下成分：①、probe qpcr mix,with ung反应液；②、无酶无菌水；③、阳性对照和阴性对照。

10、一种采用上述的试剂盒实时检测短颌鲚的方法，包括如下步骤：

11、s1：提取待检样品的dna；

12、s2：将待检样品的dna加入荧光定量pcr反应体系，混匀后离心，所述荧光定量pcr反应体系中含有上游引物hf2、下游引物hr2和探针h-mgb2；

13、s3：荧光定量pcr反应：设置阳性对照和阴性对照，将配好的荧光定量pcr反应体系置于荧光定量pcr仪后开始反应，反应程序如下：95℃反应30s；95℃反应5s，60℃反应30s，40个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号；

14、s4：通过观察荧光定量pcr的扩增曲线判断扩增结果。

15、进一步的，所述荧光定量pcr反应体系为20μl体系，包括：10μmol/l的上下游引物hf2/hr2各0.4μl；10μmol/l的h-mgb2探针0.8μl；probe qpcr mix,with ung反应液10μl；待检dna 2μl；用去离子水补齐到20μl。

16、本发明的有益效果为：

17、本发明提供一种我国长江上游外来鱼类短颌鲚的实时荧光pcr检测方法及检测所用的引物和探针。引物hf2/hr2和探针h-mgb2相结合具有特异性好、灵敏度高的特性，可以特异性检测短颌鲚的dna，检测的最低浓度可达1.8×10-6ng/ul。利用这种特异性引物和探针，可以实现无需采集鱼体样本，避免对鱼体的损伤的情况下，简便快捷且准确地对短颌鲚进行快速鉴定。检测时间大大缩短，检测结果精确、灵敏度高。

技术特征：

1.一种基于荧光pcr实时检测短颌鲚的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括上游引物hf2、下游引物hr2和探针h-mgb2，其核苷酸序列分别如下所示：

2.根据权利要求1所述的基于荧光pcr实时检测短颌鲚的引物和探针，其特征在于，扩增反应时，上游引物hf2、下游引物hr2和探针h-mgb2的摩尔比为：1：1：2。

3.一种采用权利要求1或2任一所述的引物和探针的短颌鲚检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上游引物hf2、下游引物hr2和探针h-mgb2。

4.根据权利要求3所述的短颌鲚检测试剂盒，其特征在于，还包括以下成分：①、probeqpcr mix,with ung反应液；②、无酶无菌水；③、阳性对照和阴性对照。

5.一种采用权利要求3所述的试剂盒实时检测短颌鲚的方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的实时检测短颌鲚的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr反应体系为20μl体系，包括：10μmol/l的上下游引物hf2/hr2各0.4μl；10μmol/l的h-mgb2探针0.8μl；probe qpcr mix,with ung反应液10μl；待检dna2μl；用去离子水补齐到20μl。

技术总结
本发明公开了一种基于荧光PCR实时检测短颌鲚的引物、探针及试剂盒，其引物和探针包括上游引物HF2、下游引物HR2和探针H‑MGB2。扩增反应时，上游引物HF2、下游引物HR2和探针H‑MGB2的摩尔比为：1：1：2。本发明提供一种我国长江上游外来鱼类短颌鲚的实时荧光PCR检测方法及检测所用的引物和探针。引物HF2/HR2和探针H‑MGB2相结合具有特异性好、灵敏度高的特性，可以特异性检测短颌鲚的DNA，检测的最低浓度可达1.8×10<supgt;‑6</supgt;ng/uL。利用这种特异性引物和探针，可以实现无需采集鱼体样本，避免对鱼体的损伤的情况下，简便快捷且准确地对短颌鲚进行快速鉴定。检测时间大大缩短，检测结果精确、灵敏度高。

技术研发人员：吕红健,丁钰玮,万卓坤,李筱芹,姚维志,付梅
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15