一种编码基因及其生成高透皮性能重组人源化III型胶原蛋白的应用的制作方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种编码基因及其生成高透皮性能重组人源化iii型胶原蛋白的应用。

背景技术：

1、皮肤细胞外基质中约70％-80％为胶原蛋白，主要为i型胶原和iii型胶原，i型胶原主要存在于成人皮肤、肌腱、骨组织，ⅲ型胶原主要存在于婴儿皮肤或血管内膜、肠道，i型胶原和iii型胶原与皮肤损伤修复过程和修复质量紧密相关。iii型胶原能促使真皮层成纤维母细胞增生，提高细胞活性，并被成纤维细胞作为合成胶原蛋白的原料吸收，刺激细胞更多的合成胶原蛋白、使受损老化的皮肤得到填充和修复，重建网状结构，增强受损皮肤的扩张力，恢复皮肤弹性。

2、目前，胶原蛋白的来源主要为动物源胶原蛋白，其提取方法一般为：用酸、碱水解法从动物结缔组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮等)中提取。但所得到的产品成分复杂，酸、碱处理容易使胶原蛋白失去其原本的生理活性，同时存在动物源疾病等风险，应用于人体会产生异体或异种的排斥反应，限制了其在医学组织材料领域的普遍应用。

3、随着基因工程技术的大规模应用，基因工程重组表达胶原利用模式化表达宿主以外源蛋白表达的形式成功的解决了胶原蛋白大规模制备的瓶颈。例如：可以在大肠杆菌中表达人源胶原蛋白，但是由于大肠杆菌缺乏糖基化和羟基化等蛋白翻译后修饰所必须的酶类，无法形成天然的三螺旋高级结构，在大肠杆菌中表达所得产品为未羟基化的胶原蛋白肽，其不具有高的生物学活性，并且其稳定性较差，无法长时间保存；也抑制天然结构胶原分子到胶原纤维的自组装；并且大肠杆菌需要破碎菌体来提取蛋白，破碎过程在成品目的蛋白中引入大肠杆菌菌体碎片，由于大肠杆菌系统潜在的免疫原性，大肠杆菌系统自身存在内毒素和致热源，所以存在潜在的安全隐患。而异源蛋白表达的巴斯德毕赤酵母真核表达系统具有较高的生物安全性，已获得包括美国fda在内的广泛认可，其更适于医用和食品用蛋白的异源表达。

4、人体天然iii型胶原蛋白由三条肽链向右卷曲扭成三股螺旋状。一级结构分析表明，其多肽链很长的区段序列是由gly-x-y氨基酸序列重复而成。其中，x通常为脯氨酸，y通常为羟脯氨酸和羟赖氨酸，后两种氨基酸在其他蛋白质中很少见，羟脯氨酸羟基参与链间的氢键键合，促进三螺旋结构的形成，提高胶原蛋白的稳定性和功能性。羟脯氨酸通常由脯氨酸经4-脯氨酸羟化酶的作用形成。因此使用4-脯氨酸羟化酶基因进行共表达，才能使生产出的胶原蛋白形成类似于人体本身具有的iii型胶原蛋白的三螺旋结构。此外，胶原蛋白是大分子生物活性物质，其本身不易透皮吸收，特别是其对真皮层的滋养效果十分有限，美容效果还有待提高，而小分子胶原肽的胶原活性差，因此市场需要高胶原活性和高透皮性能的重组胶原蛋白。

技术实现思路

1、基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种编码基因及其生成高透皮性能重组人源化iii型胶原蛋白的应用；本发明在人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的氨基酸序列的n端连接了透皮肽td-1的氨基酸序列，将其编码基因与4-脯氨酸羟化酶的编码基因在毕赤酵母中共表达，制得的重组人源化iii型胶原蛋白具有良好的透皮能力，其透皮性能显著优于动物来源的胶原蛋白，解决了大分子重组胶原蛋白透皮吸收困难的问题；并且其分子量很小进一步提高了透皮性能，本发明所述重组人源化iii型胶原蛋白具有三螺旋结构，其与天然存在的人源iii型胶原蛋白具有相似程度的稳定性，稳定性良好，且可以实现胶原纤维的自组装；本发明所得重组人源化iii型胶原蛋白还具有较好的抗氧化能力，对自由基的清除以及对蛋白质被羰基化修饰的两条主要途径(ros途径和rsc途径)均有良好的抑制能力，且进一步在皮肤细胞中得到了验证，提示了其具有一定的抗皮肤衰老的潜力。本发明所得重组人源化iii型胶原蛋白还具有一定的抑制黑色素生成作用，以及促创口修复能力。

2、本发明提出了一种编码基因，所述编码基因能编码人源iii型胶原蛋白α1链功能片段和透皮肽td-1，其中，人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的编码基因和透皮肽td-1的编码基因串联表达。

3、优选地，所述编码基因还能编码his标签，其中，his标签的编码基因、人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的编码基因和透皮肽td-1的编码基因串联表达。

4、his标签简称his-tag，又称多组氨酸标签，由6到10个连续的组氨酸残基组成。该标签用于许多重组蛋白，可帮助蛋白纯化，使研究人员能够从细胞或细胞裂解液中的数千个蛋白中提取靶蛋白。

5、上述人源iii型胶原蛋白α1链功能片段是能实现人源iii型胶原蛋白螺旋结构的功能片段。

6、在上述编码基因中串联his标签的编码基因，his标签结构较小，可在不影响蛋白活性的前提下高效纯化出高透皮性能重组人源化iii型胶原蛋白。

7、优选地，人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的氨基酸序列为如下任一种：

8、a.如seq id no.1所示的氨基酸序列；

9、b.seq id no.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

10、优选地，透皮肽td-1的氨基酸序列为如下任一种：

11、c.如seq id no.2所示的氨基酸序列；

12、d.seq id no.2所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

13、优选地，人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的编码基因的核苷酸序列为如下任一种：

14、e.如seq id no.3所示的核苷酸序列；

15、f.与seq id no.3限定的核苷酸序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。

16、优选地，透皮肽td-1的编码基因的核苷酸序列为如下任一种：

17、g.如seq id no.4所示的核苷酸序列；

18、h.与seq id no.4限定的核苷酸序列杂交且编码具有相同功能的多肽的核苷酸序列。

19、优选地，his标签的氨基酸序列为如下任一种：

20、a.如seq id no.5所示的氨基酸序列；

21、b.seq id no.5所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

22、优选地，his标签的编码基因的核苷酸序列为如下任一种：

23、c.如seq id no.6所示的核苷酸序列；

24、d.与seq id no.6限定的核苷酸序列杂交且编码具有相同功能的多肽的核苷酸序列。

25、所述基因簇中，his标签的编码基因、人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的编码基因和透皮肽td-1的编码基因串联表达，3个编码基因之间可以含有不影响his标签、人源iii型胶原蛋白α1链功能片段和透皮肽td-1表达的序列；也可以3个编码基因直接连接。

26、优选地，透皮肽td-1的氨基酸序列位于人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的氨基酸序列的n端。

27、优选地，his标签的氨基酸序列位于人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的氨基酸序列的c端。

28、当人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的编码基因和透皮肽td-1的编码基因串联表达时，其编码基因的核苷酸序列可以是如seq id no.7所示的核苷酸序列。

29、当his标签的编码基因、人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的编码基因和透皮肽td-1的编码基因串联表达时，其编码基因的核苷酸序列可以是如seq id no.8所示的核苷酸序列。

30、本发明还提出了一种重组载体，所述重组载体插入有上述编码基因。

31、优选地，重组载体为重组表达载体。

32、上述重组载体优选为重组组成型表达质粒，例如可以用组成型表达质粒pgapzα进行重组获得上述重组载体。

33、本发明还提出了一种重组菌，所述重组菌中含有上述编码基因和人源4-脯氨酸羟化酶的编码基因。

34、4-脯氨酸羟化酶(简称p4h)是一个四聚体，分别有两个α亚基和两个β亚基组成，上述人源4-脯氨酸羟化酶的编码基因包含：p4hα亚基的编码基因和p4hβ亚基的编码基因。

35、发明人将上述人源4-脯氨酸羟化酶的编码基因的片段简称为p4h，人源4-脯氨酸羟化酶的编码基因为自然存在的已知序列，其核苷酸序列如seq id no.9所示。

36、优选地，重组菌为毕赤酵母。

37、优选地，所述重组菌为毕赤酵母(pichiapastoris)px21，于2023年10月19日，保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc m 20231948。

38、本发明还提出了上述重组菌的构建方法，包括如下步骤：将上述编码基因与人源4-脯氨酸羟化酶的编码基因在出发菌株中共表达，得到能生成高透皮性能重组人源化iii型胶原蛋白的重组菌；

39、或者将上述重组载体与含有人源4-脯氨酸羟化酶的编码基因的重组载体在出发菌株中共表达，得到能生成高透皮性能重组人源化iii型胶原蛋白的重组菌。

40、上述出发菌株为毕赤酵母(pichiapastoris)x33，购于lnvitrogen公司。

41、本发明还提出了上述编码基因、重组载体、重组菌在生产高透皮性能重组人源化iii型胶原蛋白中的应用。

42、本发明还提出了一种重组人源化iii型胶原蛋白，所述重组人源化iii型胶原蛋白的编码基因如上述编码基因。

43、优选地，所述重组人源化iii型胶原蛋白的氨基酸序列为如下任一种：

44、a.如seq id no.10所示的氨基酸序列；

45、b.seq id no.10所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

46、优选地，所述重组人源化iii型胶原蛋白的表观分子量为22-24kda。

47、本发明还提出了上述重组人源化iii型胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：对上述重组菌的发酵液进行蛋白分离纯化得到重组人源化iii型胶原蛋白。

48、本发明还提出了上述重组人源化iii型胶原蛋白在制备化妆品或药品的应用。

49、有益效果

50、本发明采用基因工程手段获得重组人源化iii型胶原蛋白，避免了动物组织提取胶原蛋白所存在的风险；本发明利用4-脯氨酸羟化酶在体外实现人源iii型胶原蛋白α1链功能片段形成三螺旋，获得与天然存在的人源iii型胶原蛋白具有相似程度稳定性的胶原蛋白，其结构与人源iii型胶原蛋白更相似，具有更好的生物活性和良好的稳定性，其在-80℃条件下保存8周未见明显降解，便于后期美容、医疗器械等产品的开发和保存，并且其可以实现胶原纤维的自组装。

51、本发明利用毕赤酵母(pichiapastoris)x33构建出一个表达重组人源iii型胶原蛋白的组成型毕赤酵母工程菌株；毕赤酵母(pichiapastoris)x33中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子使得在发酵过程中不再需要甲醇，避免了在生产过程中使用大量甲醇所造成的污染与危险，更适合规模化生产。

52、本发明在人源iii型胶原蛋白α1链功能片段的氨基酸序列的n端连接了透皮肽td-1的氨基酸序列，使制得的重组人源化iii型胶原蛋白具有良好的透皮能力，其透皮性能显著优于动物来源的胶原蛋白，解决了大分子重组胶原蛋白透皮吸收困难的问题，且本发明所述重组人源化iii型胶原蛋白分子量较小，可以进一步促进透皮吸收；

53、本发明所得重组人源化iii型胶原蛋白还具有较好的抗氧化能力，对斑马鱼体内的氧化应激具有明显的抑制作用；

54、本发明所得重组人源化iii型胶原蛋白还具有较好的抗羰基化能力，对蛋白质被羰基化修饰的两条主要途径(ros途径和rsc途径)均有良好的抑制能力，且进一步在皮肤细胞中得到了验证，提示了其具有一定的抗皮肤衰老的潜力；

55、本发明所得重组人源化iii型胶原蛋白具有抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素生成能力，可以减少b16-f10细胞黑色素合成；

56、本发明所得重组人源化iii型胶原蛋白还具有促进角质细胞迁移的活性,具有潜在的促创口修复能力。