一株鰤诺卡氏菌菌株及其应用

本发明属于疫苗制备，具体涉及一株鰤鱼诺卡氏菌菌株及其应用。

背景技术：

1、鰤诺卡氏菌病是一种水产养殖过程中常见的病害，其主要表现是体表溃烂损伤和内脏的肉芽肿损伤，可见于多种常见经济鱼类，该病的病原为鰤诺卡氏菌。鰤诺卡氏菌是一种条件致病菌，其感染潜伏期长，初期感染症状不明显，因此较难于感染初期发现。目前，该菌的防治手段主要包括抗生素防治和化学药物防治，但由此产生的耐药菌、环境污染和食品中的残留等风险也可能增加并导致严重问题。

2、疫苗免疫是有效环保地预防和控制细菌感染的手段，但目前，市面上还没有针对鰤诺卡氏菌的疫苗，因此，开发一种可用于实际生产中的诺卡氏菌病疫苗十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供了一株生长较快的鰤诺卡氏菌菌株，所述菌株已于2023年10月20日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：nocardia seriolaeb20200724，保藏编号：cctcc m 20231950，地址：中国武汉武汉大学。

2、本发明还提供了所述鰤诺卡氏菌b20200724或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或其破碎产物或含有其的组合物在制备疫苗中的应用。

3、本发明还提供了一种鰤诺卡氏菌疫苗，所述疫苗以鰤诺卡氏菌b20200724为有效成分。

4、本发明还提供了所述鰤诺卡氏菌疫苗的制备方法，包括如下步骤：

5、s1.一级种子菌的繁殖，

6、s2.二级菌种繁殖，

7、s3.制苗菌液的制备与破碎，

8、s4.载鰤诺卡氏菌破碎菌体的壳聚糖纳米颗粒的制备，

9、s5.乳化制苗。

10、进一步地，步骤s1包括取鰤诺卡氏菌b20200724冻存菌种接种血琼脂培养基，26-30℃培养72～96小时，挑取5个以上典型单菌落，接种血琼脂培养基，26-30℃培养72～96小时，检验纯度合格后作为一级种子。

11、进一步地，步骤s2包括取一级种子菌接种bhi液体培养基，26-30℃，100-200转/分钟振荡培养150小时以上，检验其纯度后作为二级菌种。

12、进一步地，步骤s3包括取二级种子菌按体积比6％-10％接种bhi液体培养基，26-30℃，100-200转/分钟振荡培养72小时以上，5000rpm离心15min后使用pbs进行重悬，血球计数板计数后稀释至109cfu/ml备用，将制备好的菌液使用高压细胞破碎仪于1300bar的压力下进一步破碎30min，将破碎完成的菌悬液于静置保藏。

13、进一步地，步骤s4包括以1：1的比例将破碎后的制苗菌液缓慢滴加入制备好的壳聚糖溶液中，搅拌10min后，将tpp溶液以1：2-4的比例缓慢滴加入到上述溶液中，继续搅拌15min以上，制得载鰤诺卡氏菌破碎菌体的壳聚糖纳米颗粒。

14、进一步地，所述壳聚糖溶液的制备方法包括使用浓度为1％的乙酸溶液溶解壳聚糖，配制得到浓度为1mg/ml的壳聚糖溶液，于恒温磁力搅拌器上搅拌过夜，次日使用氢氧化钠溶液调节溶液的ph，使其终数值为5，再使用孔径为0.45μm的无菌滤膜将所得溶液进行过滤。

15、进一步地，所述步骤s5包括向制备好的溶液中分别加入体积分数为6％的吐温20及体积分数为2％的中链甘油三酯，使用超声破碎仪于40％振幅下均质5min，充分乳化制苗。

16、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

17、1.本疫苗制备成本低、技术门槛较低，且制苗菌株生长速度快，可短期内大量扩增，快速有效地进行疫苗生产。

18、2.本疫苗可预防鰤诺卡氏菌引起的大口黑鲈诺卡氏菌病，相对免疫保护率为73.3％，且安全性良好，不会刺激机体产生病理变化，可应用于实际生产中对大口黑鲈诺卡氏菌病的预防，减少生产过程中的经济损失。

技术特征：

1.一株鰤诺卡氏菌(nocardia seriolae)b20200724，其特征在于，所述鰤诺卡氏菌保藏于中国典藏培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20231950，保藏日期为2023年10月20日。

2.权利要求1所述的鰤诺卡氏菌b20200724或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或其破碎产物或含有其的组合物在制备疫苗中的应用。

3.一种鰤诺卡氏菌疫苗，其特征在于，所述疫苗以权利要求1所述的鰤诺卡氏菌b20200724为有效成分。

4.权利要求3所述鰤诺卡氏菌疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s1包括取鰤诺卡氏菌b20200724冻存菌种接种血琼脂培养基，26-30℃培养72～96小时，挑取典型单菌落，接种血琼脂培养基，26-30℃培养72～96小时，检验纯度合格后作为一级种子。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s2包括取一级种子菌接种bhi液体培养基，26-30℃，100-200转/分钟振荡培养150小时以上，检验其纯度后作为二级菌种。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s3包括取二级种子菌按体积比6％-10％接种bhi液体培养基，26-30℃，100-200转/分钟振荡培养72小时以上，5000rpm离心15min后重悬，血球计数板计数后稀释至109cfu/ml备用，将制备好的菌液使用高压细胞破碎仪于1300bar的压力下进一步破碎30min，将破碎完成的菌悬液于静置保藏。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s4包括以1：1的比例将破碎后的制苗菌液缓慢滴加入制备好的壳聚糖溶液中，搅拌10min后，将tpp溶液以1：2-4的比例缓慢滴加入到上述溶液中，继续搅拌15min以上，制得载鰤诺卡氏菌破碎菌体的壳聚糖纳米颗粒。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的制备方法包括：使用乙酸溶液溶解壳聚糖，配制得到浓度为1mg/ml的壳聚糖溶液，于恒温磁力搅拌器上搅拌过夜，次日调节溶液的ph，使其终数值为5，再使用孔径为0.45μm的无菌滤膜将所得溶液进行过滤。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，向制备好的溶液中分别加入体积分数为6％的吐温20及体积分数为2％的中链甘油三酯，使用超声破碎仪于40％振幅下均质5min，充分乳化制苗。

技术总结
本发明提供了一株鰤诺卡氏菌菌株及其应用，所述鰤诺卡氏菌为鰤诺卡氏菌B20200724株，保藏编号CCTCC M 20231950。利用该菌株制备的纳米浸泡疫苗可以预防鰤诺卡氏菌引起的大口黑鲈结节病，疫苗本身无毒且相对免疫保护率为73.3％，可以应用于养殖过程中大口黑鲈诺卡氏菌病的预防，降低该病的发病率，减少生产过程中的经济损失。

技术研发人员：袁军法,李柯松,孙一涵,罗杨志,邓平,顾泽茂,李莉娟
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5