一种靶向PCSK9和ANGPTL3的双特异性抗体及其制备方法与应用

本发明涉及双特异性抗体，具体涉及一种靶向pcsk9和angptl3的双特异性抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，ldl-c)水平升高已被证实是动脉粥样硬化性心血管疾病(ascvd)的独立危险因素。目前，使用他汀类药物控制ldl-c水平仍是ascvd一级预防和二级预防的基石。然而，文献(currentatherosclerosis reports,2020,22:27)表明仍有相当部分患者使用他汀类无法将血清ldl-c水平降低至预期水平(70mg/ml)或对他汀类药物不耐受。临床研究发现，他汀类强化治疗(high-intensity statin)或将他汀类药物与其它药物如依折麦布、pcsk9抑制剂联用有助于进一步降低ldl-c水平，得到更大的临床获益。然而，ascvd的发病率和致死率仍然很高(arch pharm res,2019,42(3)206-223)。

2、前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin-kexin type 9，pcsk9)是枯草杆菌丝氨酸蛋白酶家族的成员。pcsk9能够与ldlr结合，最终引导ldlr进入溶酶体中降解，减少了肝脏对血浆中ldl-c的清除。pcsk9抑制剂与pcsk9结合后，能够抑制pcsk9介导的ldlr降解，进而提高肝脏对ldl-c的清除。临床研究发现pcsk9抑制剂耐受性良好，不良反应发生率低，在他汀类耐受的患者中也具有良好的安全性。现有的pcsk9抑制剂包括单克隆抗体(如alirocumab，evolocumab)、rna干扰药物(如aln-pcs)、类抗体蛋白(如bms-962476)和人源单链抗体等，中国专利cn111620950a公开了一种抗人pcsk9全人源单链抗体ap2m21，可特异性结合pcsk9,有效抑制pcsk9介导的肝细胞表面低密度脂蛋白受体(ldlr)的降解,显著增强肝细胞对低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的摄取，从而明显降低血清ldl-c水平。但是上述专利中并没有公开ap2m21对于动脉粥样硬化的治疗效果，即使ldl-c水平与ascvd相关，但是导致ascvd发生的因素众多，无法仅从降低血清ldl-c水平的效果就可以知晓ap2m21对于动脉粥样硬化的治疗效果。

3、血管生成素样蛋白3(angptl3)是angptl家族成员，目前发现的angptls有8种，除了angptl8，其他angptls均含有氨基端介导的螺旋结构域(ccd)和羧基端介导的纤维蛋白原样结构域(fld)。angptl3分泌释放入血后，经前蛋白转化酶剪切释放angptl3的氨基端(n-terminal of angptl3，nt-angptl3)功能域，nt-angptl3与脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipase,lpl)结合使lpl构象改变，抑制了lpl对tg的水解，使tg在体内积聚，引起高甘油三酯血症。rene等的研究表明在低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,ldlr)缺乏时angptl3独立于ldlr发挥作用：抑制angptl3可使内皮脂酶(endotheliallipase,el)去抑制，促进极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,vldl)清除，限制低密度脂蛋白(low density lipoprotein,ldl)颗粒的产生，导致低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin,ldl-c)降低(journal of lipid research.61,9(2020):1271-1286.)。提示angptl3抑制剂在纯合子高胆固醇血症等ldlr缺失的患者中可有效发挥降ldl-c作用。中国专利cn116143919a公开了一种抗人nt-angptl3全人源单链抗体1519和44132，该抗体能够特异性地结合与抑制nt-angptl3的活性，降低血清tg，可用于治疗与angptl3相关的疾病，如高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症等。同样地，该专利也没有公开1519和44132单链对于动脉粥样硬化的治疗效果，无法预期1519和44132单链是否可以治疗ascvd。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种双特异性抗体，解决如何治疗动脉粥样硬化等心血管疾病的问题；本发明的另一目的在于提供双特异性抗体的重组基因，解决如何重组表达双特异性抗体的问题。本发明的第三个目的在于提供一种含有双特异性抗体重组基因的载体及宿主细胞，解决如何克隆或表达重组基因的问题；本发明的第四个目的在于提供一种双特异性抗体在制备药物组合物或治疗心血管疾病药物中的应用，解决如何应用双特异性抗体制备药物的问题。

2、技术方案：本发明所述的一种双特异性抗体，包含第一抗原结合部和第二抗原结合部，所述第一抗原结合部包含cdr1-cdr6；所述第二抗原结合部包含cdr7-cdr12和/或cdr13-cdr18，所述cdr1-cdr6的氨基酸序列如seq id no：1-6所示，所述cdr7-cdr12的氨基酸序列如seq id no：7-12所示，所述cdr13-cdr18的氨基酸序列如seq id no：13-18所示。

3、优选地，双特异性抗体的结构为单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、fab片段、f(ab’)x片段、全长抗体或结构域抗体中的一种。

4、优选地，所述第一抗原结合部为靶向pcsk9的单链抗体，所述第二抗原结合部为靶向nt-angptl3的单链抗体。

5、优选地，所述靶向pcsk9的单链抗体与靶向nt-angptl3的单链抗体通过柔性肽连接，所述靶向pcsk9的单链抗体序列为seq id no：19所示序列或其经一个或多个氨基酸添加、删除或替换的氨基酸序列；所述靶向nt-angptl3的单链抗体序列为seq id no：20或seqid no：21所示序列或其经一个或多个氨基酸添加、删除或替换的氨基酸序列。

6、为了利用基因重组技术制备上述双特异性抗体，本发明进一步构建上述双特异性抗体的重组基因，其核苷酸序列包括seq id no：26-29所示序列中的一种。

7、进一步地，本发明将上述重组基因通过多克隆位点插入常见空载体中构建一种包含上述双特异性抗体重组基因的载体。常见空载体包括质粒载体、病毒载体等。该载体为表达载体或克隆载体。

8、进一步地，本发明提供一种包含上述载体的宿主细胞。载体可以通过转染等方式导入宿主细胞中，宿主细胞可以为酵母菌、工程菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞等。

9、本发明所述的一种药物组合物，包含上述双特异性抗体及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物中还可以包含其他心血管疾病治疗剂，将双特异性抗体与其他治疗剂联用取得更好的治疗效果。

10、本发明所述的双特异性抗体可应用于制备预防、改善或治疗高脂血症和/或心血管疾病和/或脂肪肝的药物。高脂血症优选为高甘油三酯血症、高胆固醇血症、混合型高脂血症中的至少一种，心血管疾病优选为动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化性心脏病中的至少一种。

11、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明所述双特异性抗体能同时靶向抑制pcsk9和angptl3。所述双特异性抗体通过同时抑制pcsk9和angptl3能够同时降低血清ldl-c和tg，并有效抑制动脉粥样硬化斑块形成，进而有效治疗动脉粥样硬化等多种心血管疾病。本发明所述双特异性抗体能够在大肠杆菌中进行可溶性表达，制备工艺简单，生产成本低。