糖基转移酶RrUGT3基因在合成N-糖苷和S-糖苷中的应用

本发明涉及以rrugt3基因合成n-糖苷和s-糖苷，更具体地说是涉及糖基转移酶rrugt3基因在合成n-糖苷和s-糖苷中的应用。

背景技术：

1、糖苷类化合物由糖基和苷元部分组成，广泛存在于植物体内，根据糖苷键的类型可将糖苷分为o-糖苷、c-糖苷、n-糖苷和s-糖苷。许多糖苷类化合物具有重要的药用价值，n-糖苷，例如尿苷、胞苷、胸苷、鸟苷、腺苷等核苷在细胞中扮演了十分重要的角色，是很多功能分子的前体，同时参与神经调节和信号传导。由核苷进行结构改造后的奈拉宾、阿扎胞苷等是抗肿瘤药物。天然的s-糖苷例如萝卜硫苷，也具有抗肿瘤活性。

2、目前获取n-糖苷和s-糖苷化合物主要通过化学合成。1980年，schmidt等人发明糖基三氯乙酰亚胺酯法，至今依然在用，该方法使用糖基三氯乙酰亚胺酯作为糖基供体，进行糖基化时需使用大量路易斯酸，例如bf3.oet2、tmsotf等，且需要低温以及严格的无水环境，反应条件苛刻。糖基化反应的立体选择性依赖于底物上保护基的空间位阻效应，立体选择性差，糖基供体例如2,3,4,6-四-o-乙酰化-β-葡萄糖胺，反应结束后需脱去保护基，过程比较繁琐。与之相比，利用糖基转移酶来生物合成糖苷类化合物反应条件更加温和，立体选择性强，且操作简单，无需繁琐的保护去保护步骤。

3、因此，如何利用糖基转移酶rrugt3基因合成n-糖苷和s-糖苷是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了糖基转移酶rrugt3基因在合成n-糖苷和s-糖苷中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、糖基转移酶rrugt3基因在合成n-糖苷和s-糖苷中的应用，其中，rrugt3基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种以糖基转移酶rrugt3基因合成n-糖苷和s-糖苷的方法，包括下述过程：

5、(1)将糖基转移酶rrugt3基因整合至pcdfduet-1质粒中，转化至e.coli dh5α中，进行扩增，后转化至e.coli bl21中；

6、(2)接种rrugt3表达菌株e.colibl21于含有50μg/ml链霉素的lb液体培养基，过夜培养；

7、(3)按照1：100接种量将种子液接种至m9ca培养基中，37℃，220rpm培养3-4h；待od600＝0.6-0.8时，加入1mm iptg进行诱导，同时加入1mm苯胺或苯硫酚，30℃，220rpm进行发酵；48h后，离心收集上清；

8、(4)取上清液，等体积加入甲醇，混匀后高速离心取上清进行hplc检测以及ms检测以测定产物生成；

9、(5)对于饲喂苯胺的样品，等体积加入乙酸乙酯进行萃取，充分振荡混匀后静置5h后用旋转蒸发仪蒸干，甲醇溶解，经hplc制备得纯净n-糖苷；对于饲喂苯硫酚的样品以流速为1bv/h将上样液加入到ab-8大孔吸附树脂柱中，洗脱，将洗脱液进行旋蒸，蒸干后用甲醇进行溶解，再经hplc制备可得纯净的s-糖苷化合物。

10、优选地，步骤3)中，m9ca培养基包括酪蛋白水解物2.0g、na2hpo46.8g、kh2po43.0g、nh4cl 1.0g、nacl 0.5g，使用时添加4％葡萄糖，2mm mgso4以及0.1mm cacl2。

11、优选地，苯硫酚类物质包括对甲苯硫酚、3-甲基苯硫酚、对异丙基苯硫酚。

12、优选地，苯胺类物质包括对甲苯胺或对乙基苯胺。

13、优选地，步骤5)中所述洗脱为向大孔吸附树脂柱中以2bv/h的流速加入水，以除去大孔吸附树脂柱中残留的上清液以及极性较大的杂质，同样的方法冲洗3-5个柱体积；然后在大孔吸附树脂柱中加入浓度为30％-40％的乙醇水溶液进行洗脱，并收集乙醇水洗脱液，速率为1bv/h，洗脱3个柱体积。

14、优选地，大孔树脂在洗脱前需预处理，过程为：取步骤4)所得上清液体积的五分之一体积的ab-8大孔吸附树脂，将其浸泡至95％乙醇中过夜；用纯水洗涤ab-8大孔吸附树脂至无醇味，湿法装柱。

15、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护糖基转移酶rrugt3基因在制备合成n-糖苷和s-糖苷的重组载体中的应用，所述重组载体为pcdfduet-1-rrugt3。

16、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护糖基转移酶rrugt3基因在制备合成n-糖苷和s-糖苷的重组菌株中的应用，所述重组菌株为重组e.colibl21菌株。

17、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明首次发现了rrugt3基因可以合成n-糖苷和s-糖苷，因此，本发明将该基因转化至感受态细胞e.coli bl21中，经过发酵培养，可以生成n-糖苷和s-糖苷，转化效率高，且底物杂泛性高，此方法可用于大规模生产多种n-糖苷或s-糖苷类化合物。

技术特征：

1.糖基转移酶rrugt3基因在合成n-糖苷和s-糖苷中的应用。

2.一种以糖基转移酶rrugt3基因合成n-糖苷和s-糖苷的方法，其特征在于，包括下述过程：

3.根据权利要求2所述的一种以糖基转移酶rrugt3基因合成n-糖苷和s-糖苷的方法，其特征在于，步骤3)中，m9ca培养基包括酪蛋白水解物2.0g、na2hpo46.8 g、kh2po43.0 g、nh4cl 1.0g、nacl 0.5g，使用时添加4％葡萄糖，2mm mgso4以及0.1mm cacl2。

4.根据权利要求3所述的一种以糖基转移酶rrugt3基因合成n-糖苷和s-糖苷的方法，其特征在于，苯胺类物质包括对甲苯胺或对乙基苯胺。

5.根据权利要求4所述的一种以糖基转移酶rrugt3基因合成n-糖苷和s-糖苷的方法，其特征在于，苯硫酚类物质包括对甲苯硫酚、3-甲基苯硫酚或对异丙基苯硫酚。

6.根据权利要求5所述的一种以糖基转移酶rrugt3基因合成n-糖苷和s-糖苷的方法，其特征在于，步骤5)中所述洗脱为向大孔吸附树脂柱中以2bv/h的流速加入水，以除去大孔吸附树脂柱中残留的上清液以及极性较大的杂质，同样的方法冲洗3-5个柱体积；然后在大孔吸附树脂柱中加入浓度为30％-40％的乙醇水溶液进行洗脱，并收集乙醇水洗脱液，速率为1bv/h，洗脱3个柱体积。

7.根据权利要求6所述的一种以糖基转移酶rrugt3基因合成n-糖苷和s-糖苷的方法，其特征在于，大孔树脂在洗脱前需预处理，过程为：取步骤4)所得上清液体积的五分之一体积的ab-8大孔吸附树脂，将其浸泡至95％乙醇中过夜；用纯水洗涤ab-8大孔吸附树脂至无醇味，湿法装柱。

8.糖基转移酶rrugt3基因在制备合成n-糖苷和s-糖苷的重组载体中的应用，所述重组载体为pcdfduet-1-rrugt3。

9.糖基转移酶rrugt3基因在制备合成n-糖苷和s-糖苷的重组菌株中的应用，所述重组菌株为重组e.coli bl21菌株。

技术总结
本发明公开了糖基转移酶RrUGT3基因在合成N‑糖苷和S‑糖苷中的应用，涉及以RrUGT3基因合成N‑糖苷和S‑糖苷技术领域，与现有技术相比，本发明首次发现了RrUGT3基因可以合成N‑糖苷和S‑糖苷，因此，本发明将该基因转化至感受态细胞E.coli BL21中，经过发酵培养，可以生成N‑糖苷和S‑糖苷，转化效率高，且底物杂泛性高，此方法可用于大规模生产多种N‑糖苷或S‑糖苷类化合物。

技术研发人员：郭斐,李盛英,杜磊
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19