一种定点突变创制矮化黄瓜种质的方法

本发明属于生物，具体涉及一种定点突变创制矮化黄瓜种质的方法。

背景技术：

1、耕地面积随着城市建设的发展已经越来越少。因此，利用有限的耕地进行高密度种植进而增加植物生物量积累是现代农业高产的重要手段，同时也符合现代机械化农业发展的趋势。具有理想株型的植物可有效提高植株抗逆性、光合利用效率以及土地利用率。目前，植物株高普遍利用激素调控，还有一些利用基因调控；例如：在南瓜、西瓜和黄瓜中发现yabby1基因上b-region的各种不同缺失可使葫芦科瓜类作物主茎缩短；在拟南芥中，通过rnai沉默木质素合成关键基因hct的表达，使得拟南芥的株高显著降低。

2、黄瓜(cucumis sativus l.)是我国大面积栽培蔬菜之一，且是我国居民日常饮食中重要组成部分。但目前我国栽种的大部分黄瓜植株高大，需耗费大量人力、物力进行栽后管理，不符合现代农业生产发展需求。因此，培育矮化黄瓜种质具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的为培育矮化黄瓜种质。

2、本发明首先保护一种培育转基因黄瓜的方法，可包括如下步骤：降低出发黄瓜中蛋白质csmapk6的活性和/或表达量，得到转基因黄瓜；与出发黄瓜相比，转基因黄瓜的株高降低；

3、所述蛋白质csmapk6，可为(a1)或(a2)：

4、(a1)seq id no：3所示的蛋白质；

5、(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白。

6、标签具体如表1所示。

7、表1.标签的序列

8、

9、

10、上述方法中，所述降低出发黄瓜中蛋白质csmapk6的活性和/或表达量可通过突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因来实现。

11、所述蛋白质csmapk6的编码基因可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)的dna分子：

12、(b1)编码区如seq id no:2所示的dna分子；

13、(b2)核苷酸序列如seq id no:2所示的dna分子；

14、(b3)核苷酸序列如seq id no:1所示的dna分子；

15、(b4)与(b1)或(b2)或(b3)限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质csmapk6的dna分子；

16、(b5)来源于黄瓜且与(b1)或(b2)或(b3)限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同一性且编码所述蛋白质csmapk6的dna分子。

17、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质csmapk6的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质csmapk6的核苷酸序列70％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质csmapk6，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

18、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码seq id no:3所示的氨基酸序列组成的所述蛋白质csmapk6的核苷酸序列具有70％或更高，或75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

19、上述方法中，所述突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因可为将seq id no：2所示的csmapk6基因突变为csmapk6/+1bp；所述csmapk6/+1bp是在seq id no：2自5’末端起第41至42位核苷酸之间插入了1个t，保持seq id no：2的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。

20、上述方法中，所述突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因是通过将crispr/cas9系统导入黄瓜实现的；所述crispr/cas9系统包括重组表达载体；所述重组表达载体含有表达靶向所述蛋白质csmapk6的编码基因的grna的dna分子。

21、上述方法中，所述grna的靶标序列可为seq id no：1自5’末端起第359-380位所示。

22、本发明还保护突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因的物质在降低黄瓜株高中的应用；

23、所述蛋白质csmapk6，可为(a1)或(a2)：

24、(a1)seq id no：3所示的蛋白质；

25、(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白。

26、标签具体如表1所示。

27、上述应用中，所述突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因可为将seq id no：2所示的csmapk6基因突变为csmapk6/+1bp；所述csmapk6/+1bp是在seq id no：2自5’末端起第41至42位核苷酸之间插入了1个t，保持seq id no：2的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。

28、上述应用中，所述突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因的物质可为crispr/cas9系统；所述crispr/cas9系统包括重组表达载体；所述重组表达载体含有表达靶向所述蛋白质csmapk6的编码基因的grna的dna分子。

29、上述应用中，所述grna的靶标序列可为seq id no：1自5’末端起第359-380位所示。

30、实验证明，采用含有csmapk6基因编辑载体的重组农杆菌转化黄瓜品种9930，能够对csmapk6基因进行编辑，csmapk6基因通过crispr/cas9核酸内切酶编辑之后，可造成csmapk6基因突变，当两条同源染色体的csmapk6基因均发生突变时，可以导致蛋白质csmapk6活性丧失；蛋白质csmapk6活性丧失形成株高降低的黄瓜，即矮化黄瓜。采用本发明的方法能够实现对黄瓜的csmapk6基因编辑，获得矮化黄瓜。由此可见，蛋白质csmapk6可以调控黄瓜的株高，本发明具有重要的应用价值。

技术特征：

1.一种培育转基因黄瓜的方法，包括如下步骤：降低出发黄瓜中蛋白质csmapk6的活性和/或表达量，得到转基因黄瓜；与出发黄瓜相比，转基因黄瓜的株高降低；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述降低出发黄瓜中蛋白质csmapk6的活性和/或表达量通过突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因来实现；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因是通过将crispr/cas9系统导入黄瓜实现的；所述crispr/cas9系统包括重组表达载体；所述重组表达载体含有表达靶向所述蛋白质csmapk6的编码基因的grna的dna分子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述grna的靶标序列为seq id no：1自5’末端起第359-380位所示。

5.突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因的物质在降低黄瓜株高中的应用；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因为将seq id no：2所示的csmapk6基因突变为csmapk6/+1bp；所述csmapk6/+1bp是在seqid no：2自5’末端起第41至42位核苷酸之间插入了1个t，保持seq id no：2的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述突变黄瓜中蛋白质csmapk6的编码基因的物质为crispr/cas9系统；

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述grna的靶标序列为seq id no：1自5’末端起第359-380位所示。

技术总结
本发明公开了一种定点突变创制矮化黄瓜种质的方法。该方法包括如下步骤：采用含有CsMAPK6基因编辑载体的重组农杆菌转化黄瓜品种9930，能够对CsMAPK6基因进行编辑，CsMAPK6基因通过CRISPR/Cas9核酸内切酶编辑之后，可造成CsMAPK6基因突变，当两条同源染色体的CsMAPK6基因均发生突变时，可以导致蛋白质CsMAPK6活性丧失；蛋白质CsMAPK6活性丧失形成株高降低的黄瓜，即矮化黄瓜。蛋白质CsMAPK6的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。由此可见，对黄瓜的CsMAPK6基因编辑，可以获得矮化黄瓜。本发明具有重要的应用价值。

技术研发人员：夏昌选,温常龙,李颖,张建,银珊珊,张晓飞,杨静静,赵泓
受保护的技术使用者：北京市农林科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19