神经坏死病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及应用

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种神经坏死病毒的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及应用。

背景技术：

1、神经坏死病毒(nervous necrosis virus,nnv)为野田村病毒科的单链rna病毒，nnv病毒粒子很小，其直径大约为25-30nm，无囊膜，整个病毒粒子呈正二十面体，从感染的病鱼组织和细胞中观察到病毒粒子呈晶格状紧密排列，主要在细胞质中。nnv临床症状主要表现为：黑身、厌食、泳动失调、打转，幼鱼死亡率明显高于成鱼，石斑鱼幼鱼7天死亡率高达100％。病理切片检测表明感染鱼中枢神经系统大面积坏死：大脑和视网膜出现大量空泡同时伴随着炎性坏死。患病拟鲹组织切片表明除了神经系统的空泡化坏死，皮肤、鳃盖和口腔的上皮细胞也出现空泡坏死现象。

2、目前针对神经坏死病毒的检测方法主要包括免疫学检测和分子生物学检测方法(如普通pcr、实时荧光定量pcr检测方法)等，但这类检测方法的操作性、使用成本、检测场地、人员素质等方面都有一定的局限性，不能达到现场和基层实时快速监测病原的目的。与之相比，环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification method,lamp)是一种新兴的核酸扩增方法，依靠bst dnapolymerase特有的链置换功能和较强的热稳定性和根据靶基因的设计2对引物或者3对引物，可以在30-60min和60-65℃内将极少拷贝数的dna扩增数百万倍。多引物与靶区域的高符合性、针对性和bst dna聚合酶的特性使得lamp有着与实时荧光定量pcr相似的灵敏性和特异性，且较普通pcr方法的灵敏性可高出10-100倍。同时，lamp反应结果还可以通过肉眼直接观察，缩短了电泳检测所需时间，简化了lamp检测程序。因此，该技术具有方便、简单、快速、特异性高、结果可视化等优点，应用前景极为广阔。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于提供一种神经坏死病毒的lamp检测引物组、试剂盒及应用。所述引物组特异性强，利用lamp方法进行检测操作方便简单、无需昂贵的仪器设备。

2、本发明的第一个目的是提供一种神经坏死病毒的lamp检测引物组，所述的检测引物组如下所示：

3、前外引物f3:5’-gtctccaagccgagtgtg-3’(如seq id no.1所示)；

4、后外引物b3:5’-ccagcaatacgaccgtcaat-3’(如seq id no.2所示)；

5、前内引物fip:

6、5’-tgtcgtaggcactaccaactgcggtcgtgcataaacctggc-3’(如seq id no.3所示)；

7、后内引物bip:

8、5’-ttacgcgcgtgagtacgctcagctcgttggaacgtgac-3’(如seq id no.4所示)；

9、前环引物lf:5’-ttggtaatgacgagcaagatc-3’(如seq id no.5所示)；

10、后环引物lb:5’-tgactcaaactgctgtatttccaa-3’(如seq idno.6所示)。

11、本发明的第二个目的是提供神经坏死病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、bst dna聚合酶、amv反转录酶、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组，所述的检测引物组如上所述。

12、进一步，所述的阳性对照质控品为含鱼类神经坏死病毒的rdrp基因(genbank登录号为aoc89548.1)的质粒dna，可以通过从神经坏死病毒的rna反转录扩增得到；所述的阴性对照质控品为超纯水。

13、本发明还提供所述引物组在鉴定鱼类神经坏死病毒中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。

14、本发明还提供所述试剂盒在鉴定鱼类神经坏死病毒中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。

15、进一步，所述的应用方法：

16、(1)对样品进行收集，提取样品的rna作为模板；

17、(2)使用上述的神经坏死病毒的环介导等温扩增检测引物组，与环介导等温扩增反应液、bst聚合酶、amv反转录酶、钙黄绿素显色液及样品上清液混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；

18、(3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和/或凝胶电泳分析检测样品中是否含有神经坏死病毒。

19、进一步，所述的通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有神经坏死病毒具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有神经坏死病毒；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有神经坏死病毒。

20、进一步，所述的通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有神经坏死病毒具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有神经坏死病毒；若无梯状条带，则样品中不含有神经坏死病毒。

21、优选，所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μl，包括10×thermopol buffer2.5μl，5×amv rt buffer 3μl，100mmol/lmgso4 2μl，10mmol/ldntp mix 3μl，引物fip、10μmol/lbip各3μl，10μmol/l引物f3、b3各0.5μl，10μmol/l引物lf、lb 1μl，8u bst dna聚合酶1μl，amv反转录酶1μl，5mmol/l钙黄绿素显色液(含20mmol/lmncl2)0.5μl和模板1μl，余量为去离子水。

22、所述的环介导等温扩增反应的反应条件优选为：62℃反应35min，80℃终止反应5min。

23、本发发明与现有技术相比的有益效果：本发明根据神经坏死病毒(nervousnecrosis virus,nnv)的rdrp基因设计特异性引物组，具有很好的特异性，可用于检测神经坏死病毒。本发明设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该引物组的检测试剂盒和使用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定检测的样品中是否存在神经坏死病毒。本发明的检测引物组，检测试剂盒和检测方法具特异性强，操作方便简单，检测时间短，无需昂贵的仪器设备等优点，特别适合基层的现场检测，具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种神经坏死病毒的lamp检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组如下所示：

2.一种神经坏死病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括环介导等温扩增反应液、bst dna聚合酶、amv反转录酶、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组，所述的检测引物组如上所述。

3.根据权利要求2所述的一种神经坏死病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含鱼类神经坏死病毒的rdrp基因的质粒dna，通过从神经坏死病毒的rna反转录扩增得到；所述的阴性对照质控品为超纯水。

4.权利要求1所述引物组在鉴定鱼类神经坏死病毒中的应用，其特征在于，所述应用为非疾病诊断目的。

5.权利要求2所述试剂盒在鉴定鱼类神经坏死病毒中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用具体方法：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有神经坏死病毒具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有神经坏死病毒；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有神经坏死病毒。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有神经坏死病毒具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有神经坏死病毒；若无梯状条带，则样品中不含有神经坏死病毒。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μl，包括10×thermopol buffer 2.5μl，5×amv rt buffer 3μl，100mmol/lmgso42μl，10mmol/ldntp mix 3μl，引物fip、10μmol/lbip各3μl，10μmol/l引物f3、b3各0.5μl，10μmol/l引物lf、lb 1μl，8u bst dna聚合酶1μl，amv反转录酶1μl，5mmol/l钙黄绿素显色液0.5μl和模板1μl，余量为去离子水；

技术总结
本发明涉及一种神经坏死病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及应用，属于微生物检测领域。所述的LAMP引物组如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明还提供神经坏死病毒的环介导等温扩增检测试剂盒及应用，所述试剂盒包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组。本发明所述LAMP检测引物组是基于神经坏死病毒的RdRp基因为特异性靶基因设计，所制备的试剂盒特异性强、操作方便简单、无需昂贵的仪器设备。

技术研发人员：曹贞洁,孙云,周永灿,李涛,吴莹,杜和禾,张晨
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25