一种能提高粘质沙雷氏菌防治白蚁效果的OfDrosha基因dsRNA

本发明涉及生物，具体涉及一种能提高粘质沙雷氏菌防治白蚁效果的ofdrosha基因dsrna。

背景技术：

1、白蚁是世界性害虫，危害涉及房屋建筑物、水利堤坝、管线设施以及农林植物等方面，每年造成极大的经济损失。黑翅土白蚁odontotermesformosanus(shiraki)属蜚蠊目白蚁科大白蚁亚科土白蚁属的土栖性白蚁，是为害农林植物最严重的白蚁之一，可危害多种农作物和林木。此外，黑翅土白蚁还是水利堤坝的重要害虫，为害严重时可造成崩堤垮坝。该白蚁分布范围广，主要以树根、皮层、幼苗、幼树、庄稼秸杆、甘蔗、竹根、草根、水稻等为取食对象，也能取食牛粪，食性很杂。黑翅土白蚁在同一群体内由于所处的地位不同，分工不同，有不同的品级分化，包括蚁王与蚁后、有翅成虫、兵蚁、工蚁4个品级。从外部形态和生理机能上可将白蚁个体分为生殖型和非生殖型两大类。黑翅土白蚁的防治手段主要包括物理防治、生物防治和化学防治等。物理防治主要利用物理屏障如砂砾、防水薄膜、惰性粉或塑料挡板等，保护建筑物等不受白蚁危害。化学药剂防治黑翅土白蚁是目前最主要的防治手段，但是化学药剂对环境产生较大的负面影响。生物防治具有对环境友好且不伤害非靶标生物的优点。但生物防治对白蚁的防治效果较弱，利用生物技术提高生物防治的效果，是未来的发展趋势。

2、rna干扰(rna interference,rnai)是在多种酶作用下对基因表达进行调控的一种复杂过程，通过产生碎片rna能引发靶标基因的特异性沉默，具有高特异性、高效性和放大效应。rnai在害虫防治的基本原理是通过干扰外源靶标基因的转录及转录后过程，导致害虫生长发育受阻甚至致死。然而rnai技术在不同昆虫的应用中也不尽相同。dsrna需要在细胞内发挥rna干扰作用，在对昆虫进行相关研究时，让体外的dsrna进入细胞的方法主要包括显微注射法、喂食法和浸泡转染法，在此基础上还衍生出诸如病毒感染、共生体介导、转基因植物介导、纳米粒子包被、脂质体修饰等方法。由于dsrna高特异的靶向机制，因此，由dsrna介导的rnai在害虫防治方面有着较大的应用前景。

3、drosha作为rnase iii家族的核糖核酸酶，是microrna(mirna)生成通路中的核心分子。mirna是由内源发夹状转录物产生的长度为19-25个核苷酸的单链rna。由drosha和dgcr8组成的核微处理复合体，能识别和切割发夹结构的初级mirna(pri-mirna)进而产生前体mirna(pre-mirna)，然后pre-mirna通过export-5(exp5)的作用转移出细胞核，并经过细胞质的rnase iii家族核酸酶dicer剪切，产生大约22个核苷酸的双链mirna。drosha是一个大小为130-160kda的大型核蛋白，具有多个结构域，在动物中较为保守。drosha是由n端的脯氨酸，丝氨酸和精氨酸富集区域，dgcr结合区域以及含有rnaseiii酶切活性的c端区域三部分组成，其中rnaseiiidomain包含了rnaseiiida和naseriiidb和一个dsrbd。rnaseiii蛋白在其基本作用机制中表现出高度的保守性。两个rnaseiiid相互作用形成二聚体。在两个rnaseiiid之间的界面上，形成了一个单一的处理中心，其中包含两个紧密放置的催化位点，两个催化位点的任意一个均可裂解每条dsrna链。drosha蛋白通过磷酸化将其自身定位于细胞核，并形成最终的mirna加工功能。

4、最新研究表明，drosha除了在mirna生物发生中的经典功能之外，其在控制病毒感染方面有直接作用。drosha参与调控沙漠蝗虫的发育和进食过程。沉默蚜虫的drosha基因后会提高昆虫对植物次生物质的敏感性。上述研究表明，drosha蛋白在参与昆虫生长发育，取食及抗逆过程。目前，国内外关于黑翅土白蚁ofdrosha基因功能的研究国内外未见报道。明确黑翅土白蚁drosha基因在其抗粘质沙雷氏菌中的功能，从而提高生防菌粘质沙雷氏菌的防治效果，从而为白蚁生物防治的应用及推广提供理论依据。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种黑翅土白蚁基因drosha(ofdrosha)及其dsrna，并结合粘质沙雷氏菌(serratia marcescens，sm1)来防治白蚁。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明提供一种黑翅土白蚁ofdrosha基因，核苷酸序列为seq id n0:1所示。

4、本发明提供一种以上所述黑翅土白蚁ofdrosha基因在降低白蚁抗病原菌能力中的应用。

5、进一步的，所述病原菌为粘质沙雷氏菌。

6、本发明提高一种黑翅土白蚁ofdrosha基因dsrna，由以上任一黑翅土白蚁ofdrosha获得。

7、本发明还提供一种黑翅土白蚁的防治方法，通过以上任一所述黑翅土白蚁ofdrosha基因获得dsrna后，通过所述dsrna处理黑翅土白蚁6-24h后，再用粘质沙雷氏菌处理。

8、本发明还提供ofdrosha基因dsrna在提高粘质沙雷氏菌防治黑翅土白蚁上的应用，其中能提高粘质沙雷氏菌防治黑翅土白蚁效果的ofdrosha基因dsrna由如seq id n0:1所示核苷酸序列获得，ofdrosha基因dsrna的制备方法如下：

9、(1)提取黑翅土白蚁体内总rna，通过反转录获得白蚁cdna库；(2)以白蚁cdna为模板，利用ofdrosha特异性引物，通过pcr扩增ofdrosha基因片段，随后通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化ofdrosha基因片段，所述的ofdrosha特异性引物为：上游引物(5’-3’)atgtggtacaatgactcgggag，下游引物(5’-3’)ttatttcttgcctgcagacactt；

10、(3)通过ta克隆将ofdrosha基因片段导入表达载体l4440中，通过检测获得含目的基因ofdrosha的ofdrosha质粒；

11、(4)以ofdrosha质粒为模版，利用特异性引物扩增得到dsrna模板，所述上游引物(5’-3’)序列为

12、cccaagcttgtgaccgtaggattcattacatgaa，下游引物(5’-3’)序列为ccgctcgagtggtgagattttgcagcagc；

13、(5)融合后的表达载体被转化到合格细胞大肠杆菌ht115(de3)，获得dsrna-ht115工程菌株；

14、(6)使用超声波处理的方法，杀死dsrna-ht115工程菌株，同时破坏细菌的细胞壁和细胞膜，促进dsrna的释放；

15、(7)将上述所得dsrna通过滤纸喂养黑翅土白蚁后，再将粘质沙雷氏菌滴在工蚁的前胸背板。

16、进一步的，所述dsrna处理黑翅土白蚁6-24h后，再用粘质沙雷氏菌处理。

17、进一步的，所述dsrna处理黑翅土白蚁6h后，在用粘质沙雷氏菌处理。

18、本发明的有益效果：

19、本发明针对获得的黑翅土白蚁ofdrosha设计dsrna(dsofdrosha)，利用rnai技术干扰抑制了黑翅土白蚁体内ofdrosha基因的表达量；通过dsofdrosha处理后的黑翅土白蚁再接触sm1生防菌，抗菌活性和存活率显著降低，表明受菌的白蚁主动免疫被打破，并显著提高了sm1生防菌对白蚁的防治效果。本发明可应用于rnai技术结合sm1生防菌防治黑翅土白蚁。本发明防治黑翅土白蚁具有特异性强、效果优异、环境友好特点，同时还加深了黑翅土白蚁ofdrosha的生理功能及作用，还将其作为新的靶标，开发相应的免疫抑制剂，为进一步提高防治黑翅土白蚁的生物防效果提供理论依据。