用于捕获细菌的探针材料的制备方法及其在冷却肉中细菌磁分离前处理中的应用

本发明属于食品安全检测，涉及纳米技术和生物技术。具体地，尤其涉及一种可用于捕获细菌的探针材料制备方法及其在冷却肉中细菌磁分离前处理中的应用，其利用磁性复合材料的捕获性能和磁分离特性来高效率识别、分离和富集冷却猪肉样品中的细菌。

背景技术：

1、对食品中细菌数量的检测通常被用作食品质量指标，以揭示微生物的水平，预警食品的受污染程度。但是由于食品基质的复杂性，要有效分离富集细菌是颇具挑战性的。因此开发选择性强、捕获率高、分离富集时间短的前处理方法显得至关重要。近年来，磁性材料发展迅速，被广泛应用于生物学、医学等领域。其中，磁性fe3o4颗粒具有优异的超顺磁性，可用于目标物质的分离富集等领域；金属有机框架(mofs)材料，是一种多孔配位聚合物，由金属离子团簇和有机配体两部分组成。与传统的多孔材料相比，mofs具有高体积吸附能力、巨大的比表面积、有效的负载能力和优异的催化特性，在吸附、分离、催化和药物输送等相关领域得到研究和应用。

2、磁分离技术利用磁性材料的磁响应性和生物兼容性，可以实现对细菌精准、快速的分离和富集，在复杂食品样品的预处理中得到了深入研究。因此，结合磁分离技术和对细菌有识别作用的生物标记材料，旨在构建针对冷却猪肉中细菌的磁分离前处理方法，为净化食品基质和富集微量目标提供了新的选择，为发展高灵敏度和高效率的食品安全检测新技术提供了新的方向。

3、cn114181834a公开了一种聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米粒子快速富集分离金黄色葡萄球菌的方法，属于生物技术领域。本发明方法包括磁性纳米粒子与聚乙烯亚胺进行偶联、聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米粒子复合物捕获样品液中的目的菌，通过外加磁场的作用，将被捕获目标菌与样品液进行分离及重悬等步骤。本发明通过磁分离捕获到的目的菌可以直接进行后续分析；与传统的细菌磁分离方法相比，本发明方法可以对食品基质中的大部分细菌进行磁分离，不仅提高了样品中金黄色葡萄球菌分离效率，同时也降低了成本。

4、cn114480199a一种通用型分离细菌的磁性纳米材料制备方法，以期为后续更好地进行目的菌的高灵敏检测提供基础，涉及材料化学领域和生物技术领域。该方法包括磁性纳米粒子与聚乙二醇的偶联、氨苄青霉素偶联聚乙二醇偶连的磁性纳米粒子、氨苄青霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物对样品液中细菌的识别捕获以及细菌-氨苄青霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物的富集分离等步骤。通过磁分离捕获到的目的菌可以直接进行后续分析，与传统的细菌磁分离方法相比，该方法可以对食品基质中的大部分细菌进行磁分离，不仅提高了样品中细菌分离效率，同时也降低了成本。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可用于捕获细菌的探针材料制备方法及其在冷却肉中细菌磁分离前处理中的应用，该前处理方法具有选择性强、捕获率高、分离富集时间短等特点。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于捕获细菌的探针材料的制备方法，包括如下步骤：

4、将fe3o4@mil-100(fe)用超纯水洗涤并重悬于超纯水中，加入壳聚糖溶液后于室温下震荡一段时间，超纯水洗涤后磁分离去上清，获得fe3o4@mil-100(fe)@壳聚糖作为捕获探针，于4℃保存。

5、进一步，fe3o4@mil-100(fe)的制备方法如下：在fe3o4的水分散液中，加入1,3,5-苯三甲酸混合均匀，超声5-15min，转移至反应釜中110-140℃反应12-18h，冷却至室温，经洗涤、干燥，得到fe3o4@mil-100(fe)粉末。

6、进一步，在含0.2g fe3o4的水分散液中，加入0.30-0.50g的1,3,5-苯三甲酸。

7、进一步，所述fe3o4经下述处理获得：将乙二醇与六水三氯化铁、无水乙酸钠、二水合柠檬酸钠混合均匀，然后在180-220℃下加热反应10-14h，冷却至室温，经洗涤、干燥，即得。

8、进一步，在220-260ml乙二醇中加入8-10g六水氯化铁、14-15g无水乙酸钠和3-4g二水合柠檬酸钠。该方法制备获得的fe3o4表面带有羧基基团，更利于有机配体在其表面的生长。

9、进一步，壳聚糖溶液的浓度为1-2mg/ml，所述壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解于体积分数为1％的乙酸溶液中配置而成；以0.8mg fe3o4@mil-100(fe)为基准，加入壳聚糖0.5-2ml，室温震荡2-30min。

10、本发明还提供利用所述的制备方法制得的用于捕获细菌的探针材料在冷却肉中细菌磁分离前处理中的应用，包括以下步骤

11、a)将冷却猪肉样品中加入一定量的无菌生理盐水，拍打均质后取其均质液，通过差速离心去除均质液中的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白等食品基质得到处理后的样品；

12、b)将步骤a)处理后的样品与捕获探针fe3o4@mil-100(fe)@壳聚糖置于室温下反应10-40min后，超纯水洗涤后磁分离弃去上清，获得分离出的细菌。

13、进一步，步骤a)中，差速离心条件为：首先在500-2000rpm的条件下离心1-5min，然后在6000-10000rpm的条件下离心1-3min。

14、进一步，步骤b)中，样品体积为1ml，fe3o4@mil-100(fe)@壳聚糖用量为0.5-1mg。

15、进一步，步骤b)中，所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、液化沙雷氏菌、密歇根克雷伯菌或嗜根考克氏菌。

16、本发明先合成了捕获探针fe3o4@mil-100(fe)@壳聚糖，其中，捕获探针用于细菌的分离富集，接着通过差速离心法去除了冷却肉的基质对细菌捕获的影响。主要包括：先通过溶剂热法合成制备fe3o4，再在其表面原位生长mil-100(fe)从而制得fe3o4@mil-100(fe)，然后将壳聚糖通过吸附作用接合于其表面制得fe3o4@mil-100(fe)@壳聚糖，用作识别细菌；再通过差速离心去除冷却猪肉样品中肌原纤维蛋白、肌浆蛋白等食品基质对本方法的影响；最后通过捕获探针从处理后的食品样本中分离富集细菌。该方法是通过fe3o4@mil-100(fe)@壳聚糖识别细菌，利用细菌与壳聚糖之间的静电作用力，达到分离富集细菌的目的，该前处理方法具有选择性强、捕获率高、分离富集时间短等特点。

17、与现有的传统前处理方法相比，本发明具有如下有益效果：

18、1)所用材料与试剂稳定、简单且操作方便快捷；

19、2)本发明利用壳聚糖对细菌的捕获性及fe3o4@mil-100(fe)的磁分离特性实现对细菌的捕获和分离；

20、3)本发明分离富集时间短、捕获率高，前处理时间在40min内，对纯培养细菌和加标冷却猪肉中细菌的捕获率都在70％以上。

技术特征：

1.一种用于捕获细菌的探针材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的用于捕获细菌的探针材料的制备方法，其特征在于，fe3o4@mil-100(fe)的制备方法如下：在fe3o4的水分散液中，加入1,3,5-苯三甲酸混合均匀，超声5-15min，转移至反应釜中110-140℃反应12-18h，冷却至室温，经洗涤、干燥，得到fe3o4@mil-100(fe)粉末。

3.根据权利要求2所述的用于捕获细菌的探针材料的制备方法，其特征在于，在含0.2gfe3o4的水分散液中，加入0.30-0.50g的1,3,5-苯三甲酸。

4.根据权利要求2所述的用于捕获细菌的探针材料的制备方法，其特征在于，所述fe3o4经下述处理获得：将乙二醇与六水三氯化铁、无水乙酸钠、二水合柠檬酸钠混合均匀，然后在180-220℃下加热反应10-14h，冷却至室温，经洗涤、干燥，即得。

5.根据权利要求4所述的用于捕获细菌的探针材料的制备方法，其特征在于，在220-260ml乙二醇中加入8-10g六水氯化铁、14-15g无水乙酸钠和3-4g二水合柠檬酸钠。

6.根据权利要求1所述的用于捕获细菌的探针材料的制备方法，其特征在于，壳聚糖溶液的浓度为1-2mg/ml，以0.8mg fe3o4@mil-100(fe)为基准，加入壳聚糖0.5-2ml，室温震荡2-30min。

7.权利要求1-6任一所述的制备方法制得的用于捕获细菌的探针材料在冷却肉中细菌磁分离前处理中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤a)中，差速离心条件为：首先在500-2000rpm的条件下离心1-5min，然后在6000-10000rpm的条件下离心1-3min。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤b)中，样品体积为1ml，fe3o4@mil-100(fe)@壳聚糖用量为0.5-1mg。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤b)中，所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、液化沙雷氏菌、密歇根克雷伯菌或嗜根考克氏菌。

技术总结
本发明公开了一种可用于捕获细菌的探针材料制备方法及其在冷却肉中细菌磁分离前处理中的应用。通过溶剂热法及原位生长法制备Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@MIL‑100(Fe)材料作为细菌捕获探针，利用对细菌具有识别性的壳聚糖标记该材料制得Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@MIL‑100(Fe)@壳聚糖捕获探针，可用于对细菌的捕获及磁分离。在冷却猪肉中细菌前处理中的应用，利用差速离心的方法，去除冷却猪肉样品中的肌原纤维蛋白，肌浆蛋白等食品基质，以降低这些基质对本方法的影响，然后加入所制备的探针对样品中细菌进行捕获和磁分离。本发明公开的方法具有选择性强、捕获率高、分离富集时间短等优点，适用于冷却猪肉样品细菌检测时对样品中细菌的分离富集。

技术研发人员：白艳红,杜娟,赵电波,栗俊广,相启森,李宗双,黄紫琪,吴楠
受保护的技术使用者：郑州轻工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19