一种寡核苷酸脱盐工艺的制作方法

本发明涉及生物化学和生物工程领域，更具体地说，本发明涉及一种寡核苷酸脱盐工艺。

背景技术：

1、寡核苷酸是短的单链或双链dna或rna片段，在生物学和基因工程领域具有广泛的应用。寡核苷酸通常在实验室中合成，并在实验过程中经历多个纯化步骤以确保其生物活性和稳定性。在寡核苷酸的合成和纯化过程中，经常会使用到各种化学物质，例如盐、有机溶剂等。这些试剂可能对寡核苷酸的生物活性和稳定性产生负面影响，因此需要在实验过程中将其去除。此外，盐分可能影响寡核苷酸的溶解性和稳定性，因此在进行进一步实验之前，通常需要去除样品中的盐分。传统的寡核苷酸脱盐工艺，包括透析、凝胶过滤、离子交换和液相色谱等技术。这些方法各有优缺点，例如透析和凝胶过滤法需要较长的时间，且可能无法去除所有的盐分；离子交换法需要特定的树脂，可能会导致寡核苷酸的损失；液相色谱法需要昂贵的仪器和操作经验。因此，需要有一种更快速、高效且简便的寡核苷酸脱盐工艺，以改善现有技术的局限性。这将有助于提高实验室工作效率，降低实验成本。

2、磁性亲和基团脱盐寡核苷酸是一种用于分离和纯化寡核苷酸样品的高效技术，它利用磁性亲和基团作为固相吸附材料，具有特异性结合目标寡核苷酸的能力。磁性亲和基团是一种含有特定亲和性配体的磁性颗粒或微球材料。这些亲和基团可以与寡核苷酸的特定序列或结构相互作用，从而实现目标寡核苷酸的高度选择性吸附。常见的亲和基团包括与寡核苷酸互补的dna或rna序列、抗体、蛋白质或其他生物分子。磁性亲和基团脱盐寡核苷酸的脱盐提纯原理基于生物分子的特异性相互作用。当寡核苷酸样品通过磁性亲和基团时，目标寡核苷酸与亲和基团上的配体发生特异性结合，而其他非目标物质则被洗脱，从而实现了纯化和分离。

3、这种技术具有极高的选择性，因为亲和基团与特定的寡核苷酸序列或结构高度亲和，可以从复杂的混合物中高效地富集目标寡核苷酸，减少了杂质的存在。

技术实现思路

1、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

2、一种寡核苷酸脱盐工艺，包括如下步骤：

3、步骤一，离心预处理：取将寡核苷酸样品溶解在去离子水中，之后在离心机中离心，5000r/h转速离心处理15min，上清液中包含分离出的核酸；

4、步骤二，二次离心：将离心机中分离出的上清液转移到另一个干净的离心管中，重复操作进行第二次离心，以去除颗粒物和杂质；

5、步骤三，分离洗脱：使用低盐缓冲液进行洗脱核酸，以分离寡核苷酸和其他杂质；

6、步骤四，脱盐纯化处理：将处理后的寡核苷酸样品倒入清洗后的亲和色谱柱中，让寡核苷酸样品游离在亲和柱内的固相和流动相中，进行色谱分析，通过亲和色谱柱填充材料里的磁性亲和基团与寡核苷酸的特异性结合吸附柱内的寡核苷酸；

7、步骤五，进一步分离洗脱：收集磁性亲和基团吸附后的含有纯化的寡核苷酸的流出物，进行洗脱分离处理；

8、步骤六，脱水干燥处理：为了让提纯后的寡核苷酸便于保存，需要收集产物并对其进行脱水干燥。

9、作为本发明的进一步方案，所述步骤四脱盐纯化处理，选用填充材料为与寡核苷酸互补的dna和rna靶标分子结合的配体构成复合亲和色谱柱的亲和基团固相吸附材料，填充浓度为35％～50％，填充材料所固化的基质为磁铁氧体颗粒；通过表面涂层的工艺增加表面的疏水性，涂层材料为聚乙烯亚胺；亲和柱内的流动相为20％浓度的异丙醇溶剂，固相和流动相的添加体积比例为6:4。

10、作为本发明的进一步方案，所述磁性微球颗粒通过加入戊二酮作为活化剂，引入羧基、硫基、酮基等官能团；加入竹炭作为阻断剂，减少非特异性核酸结合；添加量占混合溶液的质量百分比分别为0.5％和0.1％。

11、作为本发明的进一步方案，所述步骤四脱盐纯化处理，选用的亲和色谱柱的柱结构的外部为圆柱形玻璃材质；亲和柱内部以注塑的硅基材料作为载体，一般为硅胶。

12、作为本发明的进一步方案，所述步骤三分离洗脱和步骤五进一步分离洗脱，洗脱用的低盐缓冲液具体为tris-hcl溶液，溶液浓度为20mm至50mm，ph值为7.8～8.9之间，洗脱步骤在室温条件下进行。

13、作为本发明的进一步方案，所述步骤四脱盐纯化处理，其反应时间包括平衡时间和结合时间，均在0.5～1.5小时，室温25℃条件，ph值为7.0～8.0下进行。

14、作为本发明的进一步方案，所述步骤五进一步分离洗脱和步骤六脱水干燥处理，具体操作如下：

15、步骤q1，使用外部磁场(磁铁)，将磁性吸附材料和上面附着的寡核苷酸吸引到离心管壁或容器的侧壁，一起分离出混合物，上清液(包含盐和其他离子)位于中心，去除亲和柱中的上清液，留下附着在磁性颗粒上的寡核苷酸；

16、步骤q2，对目标物再进行一次洗脱，提取磁性吸附材料上的寡核苷酸，以去除任何残留的盐和其他杂质，得到纯度较高的寡核苷酸溶液；

17、步骤q3，收集洗脱后的寡核苷酸溶液，将溶液放置在真空浓缩仪中，在减压条件下去除水分，提纯脱盐后的寡核苷酸加入荧光标记的引物储存在干燥、ph值7～8、无光照和低温条件下。

18、作为本发明的进一步方案，所述的亲和色谱柱仪器功能还包括数据收集和纯度检测功能。

19、本发明一种寡核苷酸脱盐工艺的有益效果：

20、1.这种方法能够高效地分离寡核苷酸和盐分，确保寡核苷酸的高纯度。磁性材料上的亲和基团与寡核苷酸结合，允许快速、选择性地去除寡核苷酸中的盐分。使用磁性色谱亲和柱的方法通常更温和，不会引起寡核苷酸的降解或损害，有助于减少与其他杂质的交叉反应。

21、2.磁性材料脱盐可以在较短的时间内完成，因此适用于高通量的实验。磁性材料的快速分离特性有助于提高实验的效率。相对于一次性使用的柱层析柱，磁性材料脱盐通常产生较少的废弃物，减少了环境影响。

技术特征：

1.一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述步骤四脱盐纯化处理，选用填充材料为与寡核苷酸互补的dna和rna靶标分子结合的配体构成复合亲和色谱柱的亲和基团固相吸附材料，填充浓度为35％～50％，填充材料所固化的基质为磁铁氧体颗粒；通过表面涂层的工艺增加表面的疏水性，涂层材料为聚乙烯亚胺；亲和柱内的流动相为20％浓度的异丙醇溶剂，固相和流动相的添加体积比例为6:4。

3.根据权利要求2所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述磁性微球颗粒通过加入戊二酮作为活化剂，引入羧基、硫基、酮基；加入竹炭作为阻断剂，减少非特异性核酸结合；添加量占混合溶液的质量百分比分别为0.5％和0.1％。

4.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述步骤四脱盐纯化处理，选用的亲和色谱柱的柱结构的外部为圆柱形玻璃材质；亲和柱内部以注塑的硅基材料作为载体。

5.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述步骤三分离洗脱和步骤五进一步分离洗脱，洗脱用的低盐缓冲液具体为tris-hcl溶液，溶液浓度为20mm至50mm，ph值为7.8～8.9之间，洗脱步骤在室温条件下进行。

6.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述步骤四脱盐纯化处理，其反应时间包括平衡时间和结合时间，均在0.5～1.5小时，室温25℃条件，ph值为7.0～8.0下进行。

7.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述步骤五进一步分离洗脱和步骤六脱水干燥处理，具体操作如下：

8.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸脱盐工艺，其特征在于，所述的亲和色谱柱仪器功能还包括数据收集和纯度检测功能。

技术总结
本发明涉及生物化学和生物工程领域，具体公开了一种寡核苷酸脱盐工艺，包括离心预处理、二次离心、分离洗脱、脱盐纯化处理、进一步分离洗脱以及脱水干燥处理。本发明使用亲和色谱柱脱盐提纯，通过向亲和柱内填充带有磁性的亲和基团固相吸附材料，利用寡核苷酸的特异性结合去除盐类杂质，依靠外部磁场将寡核苷酸目标物和盐类杂质分离，最后洗脱得到纯化后的高浓度寡核苷酸。该工艺简便了寡核苷酸脱盐工艺的同时也更高效地提纯寡核苷酸，能够更精确地满足工业需求，促进科研和生物医学领域的发展。

技术研发人员：侯丽强,张余,应士龙,丁家镇,尹博
受保护的技术使用者：杭州诺泰诺和生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21