一种猪CRISP3蛋白及其单克隆抗体的制备方法及应用

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种猪crisp3蛋白及其单克隆抗体的制备方法及应用。

背景技术：

1、种公猪作为猪品种改良的核心，其繁殖性能决定着养猪业的生产效益，影响公猪繁殖性能的决定性因素是精液品质。精液蛋白在精子生物学功能调节中发挥着关键的作用，是动物精子功能和繁殖性能的潜在生物标志物。探索精液蛋白对公猪精子受精能力的影响及机制，为选育高繁品系种公猪提供便捷方法。

2、猪crisp3(porcine cysteine-rich secretory protein；crisp3),最早在小鼠唾液腺和人中性粒细胞中被发现，是crisps家族中研究最少的成员，crisp3广泛表达于外分泌器官、免疫器官和生殖器官中。有研究证明crisp3参与免疫应答，具有防御作用，可抑制精子与多形核中性粒细胞结合，阻止精子在马雌性生殖道内被清除。敲除小鼠crisp3基因，囊胚率和产仔数明显降低。在人类中，crisp3存在于多种组织中，其表达差异与前列腺癌等不同病理有关，乳腺癌、精索静脉曲张、前列腺炎和子宫内膜异位症等。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种猪crisp3蛋白及其单克隆抗体的制备方法及应用。

2、一种猪crisp3蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、所述的蛋白，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、上述蛋白在制备抗炎药物中的应用。

5、上述蛋白在抑制炎症因子表达中的应用。

6、所述的细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6中的至少一种。

7、一种猪crisp3蛋白的制备方法，包括以下步骤：

8、(1)将crisp3基因与pmd18-t载体连接后得到crisp3-18t重组质粒，并转化感受态细胞；

9、(2)从步骤(1)中制备得到的感受态细胞中提取克隆质粒，酶切后得到crisp3片段，回收后与线性化的plvx-mcmv-zsgreen-ires-puro载体连接，得到plvx-mcmv-crisp3-zsgreen-ires-puro重组质粒，并转染293t细胞；

10、(3)收集步骤(2)中转染293t细胞上清病毒液浓缩后感染cho-k1细胞，利用筛选培养基筛选一周后，收集cho-k1-crisp3细胞上清并离心，收取上清得到猪crisp3蛋白。

11、步骤(1)中所述的感受态细胞为jm109感受态细胞。

12、步骤(3)中所述的筛选培养基为6μg/ml嘌呤霉素。

13、步骤(3)中所述的离心的条件为1500～2500rpm下离心5～10min，优选为2000rpm下离心7min。

14、一种猪crisp3蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

15、s1.取猪crisp3蛋白与佐剂混合，对实验动物进行初次免疫；

16、s2.初次免疫14天后，取猪crisp3蛋白与佐剂混合，对实验动物进行第二次免疫；

17、s3.第二次免疫14天后，取猪crisp3蛋白与佐剂混合，对实验动物进行第三5次免疫；

18、s4.第三次免疫7天后，采集实验动物脾细胞与sp2/0细胞融合制备杂交瘤细胞；

19、s5.经过亚克隆及阳性杂交瘤细胞株的筛选，得到稳定分泌单克隆抗体的细胞株；

20、s6.对实验动物进行腹水制备，并抽取腹水进行抗体纯化。

21、步骤s1中所述的佐剂为弗氏完全佐剂。

22、步骤s2中所述的佐剂为弗氏不完全佐剂。

23、步骤s3中所述的佐剂为弗氏不完全佐剂。

24、所述的混合为充分乳化。

25、所述的猪crisp3蛋白与佐剂混合后，猪crisp3蛋白的剂量为50～150μg，优选为100μg。

26、步骤s6中所述的纯化为使用层析柱纯化，优选为使用protein a/g-sepharose层析柱纯化。

27、所述的猪crisp3蛋白在制备单克隆抗体中的应用。

28、一种猪crisp3蛋白单克隆抗体，通过上述制备方法制备得到。

29、所述的猪crisp3蛋白单克隆抗体在选育高繁品系种公猪中的应用。

30、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

31、(1)针对现有技术中存在的难以表达猪crisp3蛋白的问题，本发明设计了一种猪crisp3蛋白的真核表达纯化与单克隆抗体制备的研究方法。crisp3蛋白在plvx-mcmv-zsgreen1-ires-puro载体且在cho-k1细胞中分泌表达，该方法表达的蛋白接近天然蛋白，操作简单；

32、(2)确定了crisp3重组蛋白以细胞分泌的形式表达并在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的胶图上可以观察到单一的目标蛋白条带；

33、(3)通过qrt-pcr和western blot实验验证，crisp3重组蛋白能够有效抑制lps诱导的炎症因子的表达，具有制备抗炎药物的潜力。

34、(4)制备的crisp3单克隆抗体具有特异性；本方法为日后研究猪crisp3蛋白在生殖中的作用机制和蛋白功能的领域提供原始材料以及科研数据。

技术特征：

1.一种猪crisp3蛋白，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：

3.权利要求1或2所述的蛋白在制备抗炎药物中的应用。

4.一种猪crisp3蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

6.一种猪crisp3蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

8.权利要求1或2所述的猪crisp3蛋白在制备单克隆抗体中的应用。

9.一种猪crisp3蛋白单克隆抗体，其特征在于：

10.权利要求9所述的猪crisp3蛋白单克隆抗体在选育高繁品系种公猪中的应用。

技术总结
本发明提供了一种猪CRISP3蛋白及其单克隆抗体的制备方法及应用。针对现有技术中存在的难以表达猪CRISP3蛋白的问题，本发明设计了一种猪CRISP3蛋白的真核表达纯化与单克隆抗体制备的研究方法。CRISP3蛋白在pLVX‑mCMV‑ZsGreen1‑IRES‑Puro载体且在CHO‑K1细胞中分泌表达，该方法表达的蛋白接近天然蛋白，操作简单；通过RT‑PCR和Western blot实验验证，CRISP3重组蛋白能够有效抑制LPS诱导的细胞因子增殖，具有制备抗炎药物的潜力；本方法为日后研究猪CRISP3蛋白在生殖中的作用机制和蛋白功能的领域提供原始材料以及科研数据。

技术研发人员：卫恒习,卜永辉,张文浩,张守全,李莉
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24