一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用。

背景技术：

1、核酸是普遍存在于各种生物(包括细菌、病毒等)中的遗传信息载体，不同的生物其具有相应的特异性核酸序列，因此，通过核酸的检测，能够获知生物的存在以及数量的相关信息，因此应用广泛。而核酸检测主要依赖于核酸扩增技术这一分子生物学领域的常用技术，其中，聚合酶链反应(pcr)是目前使用最为广泛的dna扩增技术，然而其存在一些局限：(1)由于其通常包括变性、退火等步骤，因此在应用上依赖于大型仪器，如高质量的热循环仪，因此难以在基层推广应用；(2)检测周期长，步骤繁琐，包括样本处理、核酸提取、扩增和分析等多个步骤，耗时长，同时需要熟练的技术人员进行操作；(3)常引起非特异性扩增。

2、自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的核酸恒温扩增技术，滚环扩增技术(rca)是其中最典型的之一，它借鉴自然界中环状病原微生物dna分子的滚环式的复制方式，可在恒温下发生扩增。如今已经发展出第一代线性滚环扩增(lrca)技术和第二代超分支滚环扩增(hrca)技术。

3、人乳头瘤病毒(human papilloma virus，hpv)是一种dna病毒，与人宫颈癌的发生、发展密切相关。根据基因组特定区段的序列差异，hpv被分为不同的型，其中hpv16型和hpv18型最为常见。体外快速检测hpv16/hpv18型核酸，对宫颈癌的早期筛查意义重大。然而上述的聚合酶链反应(pcr)方法，由于步骤繁琐，对温度要求高，有对大型仪器的依赖性，测试成本高，不适用于欠发达地区，极大限制了这种检测方法广泛使用。

技术实现思路

1、为克服上述缺陷，本发明提供一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法及其应用，旨在解决上述的技术问题。

2、本发明提供一种基于切刻酶偶联滚环扩增的检测方法，包括以下步骤：

3、s1.设计并合成探针1、探针2、探针3以及环状rca模板，其中：

4、所述环状rca模板包括多个重复序列，由多个所述重复序列首尾串联而成；

5、所述探针1包括目标基因前端识别序列以及与所述探针3的序列结合的序列；

6、所述探针2包括目标基因后端识别序列、切刻酶的识别位点序列以及与所述环状rca模板的重复序列相同的序列；

7、所述探针3为与所述探针1序列结合的序列；

8、s2.连接反应：配制连接反应体系，所述连接反应体系包括所述探针1、探针2、连接酶和待测样品核酸；

9、s3.恒温扩增反应：向所述s2连接反应产物中加入反应液，所述反应液包括所述环状rca模板、所述探针3、聚合酶、切刻酶；

10、s4.在s3恒温扩增反应产物中加入核酸染料，得到混合物，之后检测产物，判断待测样品核酸中是否存在目标基因。

11、进一步的，所述环状rca模板由5个所述重复序列首尾串联而成。

12、进一步的，所述环状rca模板的序列为ggttattattggttattattggttattattggttattattggttattatt(seq id no.1)。

13、进一步的，所述s4中检测产物采用酶标仪或纸基芯片。

14、进一步的，所述s4中检测产物采用所述酶标仪时，具体操作为在激发波长为495nm、发射波长为537nm时读取荧光读数，所述核酸染料为sybr gold混合物，所述sybrgold混合物包括0.6μl的100×sybr gold和9.4μl的ddh2o；

15、进一步的，所述s4中检测产物采用所述纸基芯片时，具体操作为将混合物添加至采用纸基芯片的圆形上样区，10分钟后读数，所述核酸染料为sybr green i混合物，所述sybr green i混合物包括3μl的100×sybr green i、3μl的1％tween 20和4μl的ddh2o。

16、进一步的，所述连接酶为t4连接酶，所述连接反应体系的组份及配比为：以单管反应体系10μl计，1×t4 buffer、终浓度均为50nm的探针1和探针2、2.5u的t4连接酶、1μl的浓度为100am-100nm的待测样品核酸，所述1×t4buffer包括50mm的tris-hcl、10mm的mgcl2、1mm的atp、1mm的二硫苏糖醇和5％(w/v)聚乙二醇8000，所述1x t4 buffer的ph为7.6，所述连接反应的反应条件为室温，反应时间为10分钟。

17、进一步的，所述聚合酶为phi29 dna聚合酶，所述切刻酶为nb.bbvci，所述反应液的组份及配比为：以单管反应体系10μl计，1μl的10×phi29缓冲液、10mm的dntps、80nm纯化的环状rca模板、6u的phi29 dna聚合酶和4u的nb.bbvci，所述10×phi29缓冲液的组份及配比为：50mm的tris-hcl、10mm mgcl2、10mm(nh4)2so4和4mm dtt，所述10×phi29缓冲液的ph为7.5，所述恒温扩增反应的反应条件为37℃，反应时间为45分钟。

18、本发明还提供一种hpv的检测方法，采用如上述的检测方法，所述目标基因为hpv16 e7 mrna中的序列，所述目标基因的序列为gtgctttgtacgca caaccgaagcgtagagtcacacttgcaacaaaaggttacaatattgtaa tgggctc(seq id no.2)，所述探针1的序列为gactctactacatactact acatactactacatactactaca(seq id no.3)，所述探针2的序列为ggttattattggttattattggtcctcagcgcaagtgt(seq id no.4)，所述探针3的序列为tgtagtagtatgtagtagtatgtag(seq id no.5)。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

20、1、本发明提供的检测方法将切刻酶与滚环扩增技术相结合，具有较高的灵敏度和特异性，具有良好的性能，能够对低浓度的致癌mrna水平进行准确检测；

21、2、本发明提供的检测方法反应条件温和，大部分反应条件为37℃，反应时间短，因此检测速度快，可以在短时间内准确检测出目标基因的存在；

22、3、本发明提供的检测方法操作简单，设备需求低，无需操作大型设备，所需的设备体积小、便携，整个反应可以在该设备中进行，可以方便地在不同地点进行使用，无需送往实验室分析，可以直接在临床现场使用，不仅提供了及时的结果，还减少了样本处理和运输的时间和成本，能够更好地满足欠发达地区的检测需求；

23、4、本发明提供的检测方法成本低，传统的检测方法往往需要昂贵的设备和耗材，使得检测成本居高不下，而本发明的检测方法采用了更简化的设备和读数方式(纸基芯片)，从而降低了整体的检测成本；

24、5、本发明能在体外快速检测hpv，不仅操作简单易行，适用于大量样本的筛查，且适宜在实验条件有限的平台实施，能更好地满足欠发达地区宫颈癌筛查项目的检测需求。