代替荧光蛋白的可视化质粒及其相关应用

本技术属于生物工程，具体涉及三种代替荧光蛋白的可视化质粒及其制备方法和应用，以及一种利用可视化质粒代替荧光蛋白评价植物原生质体转化及转化效率的可视化方法。

背景技术：

1、植物的原生质体在生物工程领域可以用于瞬时的遗传转化、体细胞融合和植株再生。

2、目前，许多物种中都成功建立了peg介导的原生质体瞬时转化技术，该技术可以应用于生物大分子定位、互作，基因编辑工具开发以及单细胞测序等。

3、原生质体瞬时转化技术包括原生质体的分离、纯化、转化和转化效率评价这四个主要步骤，其中转化效率评价是原生质体转化实验中必不可少的质控步骤。

4、据了解目前几乎所有的评价方法都是基于荧光蛋白的，如gfp、rfp、mcherry等。

5、主要原理是转化成功的原生质体细胞表达质粒上的荧光蛋白，在荧光激发光下产生荧光，与无荧光细胞对比即可计算出转化效率。

6、但在实际操作中，往往只需知道转化是否成功，来排除试剂配置和操作失误的问题，从而及时终止后续实验以避免浪费时间。

7、这种基于荧光蛋白的方法不能在普通光学显微镜下快速进行观察，并且需要依赖昂贵的激发光源设备和额外的操作步骤。

8、目前尚未出现技术成熟的使用非损伤、肉眼可见的技术方法来评价原生质体的转化效率的应用技术。

9、甜菜红素和甜菜黄素是石竹目植物特有的植物色素。

10、其合成途径是以酪氨酸为底物，经p450氧化酶（cyp76ad1）羟基化转变为l-3 ,4-二羟基苯丙氨酸（l-dopa），l-dopa可被cyp76ad1进一步氧化为cyclo-dopa。

11、l-dopa还可被l-dopa 4，5-二加氧酶（doda）转变为甜菜酸（betalamic acid），甜菜酸一方面可与cyclo-dopa在葡萄糖基转移酶（gt）催化下产生甜菜红素，另一方面可与氨基酸或氨基基团自发反应形成甜菜黄素。

12、因此理论上来说，只需要cyp76ad1，doda和gt三个基因就可以在生物体内重构甜菜红素和甜菜黄素的代谢通路。

13、近些年，相关研究利用甜菜红素系统，将这三个基因通过自剪切多肽进行融合表达，形成人工合成的ruby基因，成功应用于转基因植株的可视化筛选。

14、目前该从头合成策略不仅在烟草、棉花等植物中成功应用，在酵母、家蚕中也同样成功应用。

15、此外，甜菜红素和甜菜黄素不仅具有肉眼可见的红色和黄色，在绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的激发波长范围内同样有对应的强烈自发荧光。

16、但是现有研究中ruby基因并未见作为原生质体的报告基因，可能存在四个主要的原因：（1）ruby基因长达3951 bp，而多数原生质体转化系统存在质粒越大转化效率越低的情况，（2）有研究表明位于自剪切多肽后方的基因表达量会低于前方的基因，因此通过单个表达框表达ruby，在原生质体这种瞬时转化系统中可能无法积累足够的甜菜色素。

17、（3）与转基因植物中有持续的ruby代谢前体物质酪氨酸不同，原生质体分离后无额外的酪氨酸来源。

18、同时ruby基因在表达过程中涉及多种中间代谢物，可能存在中间代谢物运出细胞或进入其它代谢方向导致最终不能积累足够的甜菜色素导致无法肉眼可见细胞变色。

19、（4）现阶段虽然可以通过外源施加底物的方式进行补充，但使用常规的施加方法（如转化后的孵育阶段施加）未见或极少见转化ruby后的细胞出现颜色。

20、综上，现有的技术不能在原生质体中通过质粒转化稳定积累并使用甜菜色素。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了三种代替荧光蛋白的可视化质粒及其制备方法和应用，以及一种利用可视化质粒代替荧光蛋白评价植物原生质体转化及转化效率的可视化方法。

2、相较于现行的荧光蛋白报告系统对于激发光源设备依赖的局限性，本发明提供的质粒、可视化方法及相关应用是一种非损伤，低成本，肉眼可见的原生质体转化报告系统，利用原生质体代谢底物l-dopa产生甜菜红素和甜菜黄素，设计了新型的原生质体转化报告系统。

3、在本发明中命名为btx 报告系统。

4、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

5、本发明提供了代替荧光蛋白的可视化质粒，所述可视化质粒包括puc-ruby、puc-tddoda和puc-doda；

6、所述可视化质粒puc-ruby中代替荧光蛋白的基因包括ruby基因；

7、在本发明中，所述ruby基因中包括cyp76ad1基因、doda基因和gt基因；

8、所述cyp76ad1基因表达的cyp76ad1蛋白的氨基酸序列如专利cn 112063649 a中seq id no.1所示；

9、所述doda基因如seq id no.2所示：

10、所述gt基因表达的gt蛋白的氨基酸序列如专利cn 112063649 a中seq id no.3所示

11、所述可视化质粒puc-tddoda中代替荧光蛋白的基因包括如seq id no.1所示的tdtomato基因和如seq id no.2所示的doda基因；

12、所述可视化质粒puc-tddoda中代替荧光蛋白的基因包括如seq id no.2所示的doda基因。

13、本发明提供的三个质粒转化进入原生质体后表达的基因，可以代谢底物l-dopa，使原生质体细胞产生肉眼可见的甜菜红素或甜菜黄素。

14、这两种色素在光学显微镜下肉眼可见，可以直观判断原生质体转化实验是否成功。

15、在本发明中，所述可视化质粒的载体骨架包括puc系列的载体骨架；所述载体骨架上还包括启动子35s和终止子为nos。

16、本发明优选使用的载体骨架为puc-2×35s-egfp。

17、在本发明中，所述可视化质粒puc-tddoda中tdtomato基因和doda基因利用如seqid no.3所示的dna连接单元连接。

18、在本发明中，所述tdtomato基因和doda基因以任意顺序连接；所述dna连接单元为自剪切多肽序列；进一步优选的，所述dna连接单元为seq id no.3所示的自剪切多肽f2a序列。

19、在本发明中，扩增所述ruby基因的引物如seq id no.4和seq id no.5所示；

20、扩增所述tdtomato基因的引物如seq id no.6所示和seq id no.7所示；

21、扩增所述附带有dna连接单元的doda基因的引物如seq id no.8所示和seq idno.9所示；

22、扩增所述doda基因的引物如seq id no.10所示和seq id no.11所示。

23、本发明提供了上述任一项所述的可视化质粒在代替荧光蛋白在判断植物原生质体转化是否成功中的应用。

24、本发明提供了上述任一项所述的可视化质粒在代替荧光蛋白在评价植物原生质体转化效率中的应用。

25、本发明提供了一种代替荧光蛋白评价植物原生质体转化及转化效率的可视化方法，所述方法包括原生质体转化溶液的配置和转化流程；

26、所述原生质体转化溶液包括浓度为10mm的l-dopa；

27、所述转化流程为：将上述任一项所述的可视化质粒和底物共同转化进入细胞。

28、在本发明中，所述原生质体转化溶液的体系如表1所示。

29、本发明提供了配套的原生质体转化试剂和转化方法，在不添加底物l-dopa时转化上述三个质粒，甜菜色素报告系统不能正常工作。

30、而在过夜孵育阶段添加l-dopa，细胞则不能高效地摄取底物，所以不能稳定工作。

31、为此本发明采取了底物与质粒共转化原生质体转的方法。

32、转化结束后，未摄取底物被w5重悬液置换，所述w5溶液体系如表2所示。

33、表1 原生质体转化溶液的体系

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35、表2 w5溶液体系

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37、本发明还提供了上述可视化方法在提高原生质体摄取底物的效率中的应用。

38、本发明还提供了上述可视化方法在判断原生质体转化是否成功中的应用。

39、本发明还提供了上述可视化方法在评价原生质体转化效率中的应用

40、由实施例可知本发明提供的报告系统与常用地荧光蛋白在判断原生质体转化效率的实际使用效果。

41、使用本发明提供地两个质粒puc-tddoda和puc-doda。

42、这两个质粒可用于比较甜菜色素颜色及其自发光与荧光蛋白之间的强度和稳定性。

43、所述puc-tddoda质粒的作用在于，通过将tdtomato和doda置于同一表达框下，同时转录和翻译，可以更准确比较甜菜黄素和荧光蛋白这两类报告系统的亮度和稳定性。

44、所述红色荧光蛋白tdtomato的亮度和光稳定性明显优于常用的egfp、mcherrry和venus等其它荧光蛋白。

45、所述puc-doda质粒的作用在于，相比puc-tddoda可以进一步提高doda基因的表达量。

46、因为有研究表明自剪切多肽后方的蛋白表达会有稍许下降。

47、通过分别转化puc-doda和puc-egfp，即可比较doda和egfp两个报告系统计算出的转化效率。

48、本发明的有益效果体现在：

49、本发明利用了甜菜色素代谢物来评价原生质体转化和转化效率。

50、本发明中基于甜菜黄素的报告系统puc-tddoda和puc-doda，均能稳定指示转化成功的细胞，且自发光强度优于红色荧光蛋白tdtomato和egfp，能完美的代替荧光蛋白在评价原生质体转化效率中的作用。

51、该技术的出现极大简化原生质体转化实验，摆脱荧光光源的依赖，降低原生质体转化技术的使用门槛。

52、甜菜红素和甜菜黄素的代谢流程图如图1所示。