与I型烟草蔗糖酯基因qSE443紧密连锁的共显性SSR标记及应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种与i型烟草蔗糖酯基因qse443紧密连锁的共显性ssr标记及应用。

背景技术：

1、栽培烟草中的蔗糖酯是其叶片表面化学主要成分之一，也是烟草中重要的潜在致香前体物质，其主要是蔗糖四酯，降解后可产生小分子挥发性脂肪酸并可极大地提高烟叶的香气品质。

2、研究表明，栽培烟草中的蔗糖四酯依据分子量的大小不同，可分为6种类型，即，i型烟草蔗糖酯～vi型烟草蔗糖酯；进一步依据是否含有酯化的3-甲基戊酸基团(即，3-甲基戊酰)，可将6种类型的蔗糖四酯分为i、ii型不含3-甲基戊酰的蔗糖酯(se)和iii型～vi型含有3-甲基戊酰的蔗糖酯(bmvse)(vontimitta v,danehower d a,steede t,moon h s,lewis r s,analysis of a nicotiana tabacum l.genomic region controlling twoleaf surface chemistry traits.journal of agricultural and food chemistry,2010,58:294-300.)。不同栽培烟草类型中蔗糖四酯的结构类型和含量存在较大差异，烤烟、白肋烟和马里兰烟中含有i型和ii型烟草蔗糖酯(se)，不含或含有痕量的bmvse；而香料烟和雪茄烟则刚好相反，含有bmvse，不含或含有痕量的se。

3、栽培烟草中的蔗糖酯经硅烷化气相色谱质谱(gc-ms)进一步解析后，依据葡萄糖环部分特征碎片离子大小又可将两种不含3-甲基戊酰的蔗糖酯(se)分为se443(i型烟草蔗糖酯)和se457(ii型烟草蔗糖酯)，此2种类型烟草蔗糖酯也是培育含高蔗糖酯而具有高香气品质烤烟新品种的核心关注点。

4、但是，现有技术往往错误的将原本分别属于se443(i型)、se457(ii型)、bmvse471(iii型)、bmvse485(iv型)、bmvse499(v型)和bmvse513(vi型)六个不同独立基因视作一个基因(而且统一命名为bmvse)进行遗传定位研究(vontimitta v,danehower d a,steedet,moon h s,lewis r s,analysis of a nicotiana tabacum l.genomic regioncontrolling two leaf surface chemistry traits.journal of agricultural andfood chemistry,2010,58:294-300.)。故此，获得的定位结果是错误的。导致远未达到分子标记辅助选择(mas)100％精准要求。

5、比如，bmvse基因被定位于ssr标记pt30354和pt52061、pt61362之间约5.2cm区域内，且与ssr标记pt30209和pt20315呈共分离(vontimitta v,danehower d a,steede t,moon h s,lewis r s,analysis of a nicotiana tabacum l.genomic regioncontrolling two leaf surface chemistry traits.journal of agricultural andfood chemistry,2010,58:294-300.)。但利用上述5个ssr标记对不同遗传背景的烟草材料及192份重组自交系群体进行bmvse筛选验证，结果表明仅2个标记(pt20135和pt30354)可使用，且该2个可用标记的基因型与bmvse表型的一致率仅约92.165％(陈彪，陈铭，李洋洋，屈亚芳，程立锐，杨爱国，胡日生，刘旦，罗成刚，向世鹏，冯全福，常爱霞，烟草糖酯ssr分子标记筛选及辅助育种应用.中国烟草科学,2019,40(3):8-15.)，远未达到用于分子标记辅助选择要求的100％一致率。主要原因为：文献的作者错误的将原本分别属于六个不同独立基因(i～vi型)视作一个基因。此外，针对含有3-甲基戊酰的蔗糖酯(bmvse)已有研究报道，并进行了相应的专利，如iii型烟草蔗糖酯bmvse471(zl 2021 1 1346741.1)、iv型烟草蔗糖酯bmvse485(zl 2021 1 1363676.3)和v型烟草蔗糖酯bmvse499(申请号202111394234.5)三种类型烟草糖脂基因已被分别定位并获得可用于指导烟草高香气品质育种的两侧紧密连锁标记。但迄今，尚未见到针对2种不含3-甲基戊酰的烟草蔗糖酯(se；i型蔗糖酯se443和ii型蔗糖酯se457)的研究报道。

6、鉴于此，本发明首先将栽培烟草中的蔗糖四酯进行是否含3-甲基戊酰区分，即，不含3-甲基戊酰基团的i～ii型烟草蔗糖酯(se)与含3-甲基戊酰基团的iii～vi型烟草蔗糖酯(bmvse)；其次，以优质多抗雪茄烟品种beinhart1000-1(含bmvse，不含se)和烤烟品种红花大金元(含se，不含bmvse)为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建一个含有341份株系的烟草重组自交系(rils_f8:9)为作图群体；再次，利用数量性状连锁分析(qtl)法和硅烷化气相色谱质谱(gc-ms)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与i型烟草蔗糖酯基因qse443紧密连锁的共显性ssr标记，以弥补现有技术和已报道文献的不足、加速分子标记辅助选择(mas)在烟草高香气品种选育中的精准、高效利用。

7、因此，首次将不含3-甲基戊酰的se中包含的se443(i型)和se457(ii型)2种类型烟草蔗糖酯进行区分与遗传定位研究，既有效的填补了国内外关于se443(i型)和se457(ii型)定位分析的空白，又可精准获得与其中某一独立基因(qse443或qse457)紧密连锁的共显性ssr标记，是精准、高效利用分子标记辅助选择(mas)培育含高蔗糖酯而具有高香气品质烤烟新品种的重要途径。

技术实现思路

1、本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种与i型烟草蔗糖酯基因qse443紧密连锁的共显性ssr标记及应用。

2、本发明的第一目的在于提供一种与i型烟草蔗糖酯基因qse443紧密连锁的共显性ssr标记；第二目的在于将上述共显性ssr标记应用于检测烟草基因组dna中是否存在i型烟草蔗糖酯基因qse443及待测植株中的i型烟草蔗糖酯的基因型状态。

3、本发明的创新点：本发明首次针对不含3-甲基戊酰的i型烟草蔗糖酯基因qse443进行遗传与定位分析；发现了现有技术中的一个重大错误认识。

4、本发明人发现，文献中将i～vi型烟草蔗糖酯混为一个基因(bmvse)进行定位是不准确的，甚至是错误的，应该在上述六种类型烟草蔗糖酯中具体选择一种类型才能精确定位。现有技术的这个错误或不足，严重地制约了利用与i、ii型烟草蔗糖酯基因(qse443和qse457)紧密连锁标记开展高香气烟草新品种的选育进程。

5、本发明人的研究表明，i型和ii型烟草蔗糖酯(se)属于典型的数量性状，且受烤烟类型品种红花大金元基因组内不同染色体的qtls控制，这些基因/qtls被暂命名为qse443和qse457。

6、本发明采用如下技术方案实现。

7、一种与i型烟草蔗糖酯基因qse443紧密连锁的共显性ssr标记，本发明所述的与i型烟草蔗糖酯基因qse443紧密连锁的共显性ssr标记的编号为tmc42465和tmc42467，其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seq id no.1和seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。

8、seq id no.1：

9、aaatggcgattggtggagtcaatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatattattattctgttttccggattacgcctaatataaaaagttatttgttgatataggtcaatgatattgtatcaagtctttctaatgtatgcacattgcacagaatataaactcatatttttaaaatttgataactgataatggttgtgccaacccctggtttcactacatctcccactgttttgaggct。

10、seq id no.2：

11、aaatggcgattggtggagtcaatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatattattattctgttttccggattacgcctaatataaaaagttatttgttgatataggtcaatgatattgtatcaagtctttctaatgtatgcacattgcacagaatataaactcatatttttaaaatttgataactgataatggttgtgccaacccctggtttcactacatctcccactgttttgaggct。

12、seq id no.3：

13、caactgctgagattcgattacgtgtatatacatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatagattaaaaaagtcaccatctatcgataaatatttgtctctaaacccagttattattgtacgctaacttaaggttacaataaaatctataaaattcaaatttggaatccaattctgcttactaacggccttagtccggtcaaaaagaca。

14、seq id no.4：

15、caactgctgagattcgattacgtgtatatacatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatagattaaaaaagtcaccatctatcgataaatatttgtctctaaacccagttattattgtacgctaacttaaggttacaataaaatctataaaattcaaatttggaatccaattctgcttactaacggccttagtccggtcaaaaagaca。

16、本发明所述共显性标记tmc42465和tmc42467位于目的基因qse443两侧。

17、本发明所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：

18、扩增tmc42465的引物序列为：

19、tmc42465f：5’-aaatggcgattggtggagt-3’(seq id no.5)，

20、tmc42465r：5’-agcctcaaaacagtgggaga-3’(seq id no.6)；

21、扩增tmc42467的引物序列为：

22、tmc42467f：5’-caactgctgagattcgattacg-3’(seq id no.7)，

23、tmc42467r：5’-tgtctttttgaccggactaagg-3’(seq id no.8)。

24、上述的与i型烟草蔗糖酯基因qse443紧密连锁的共显性ssr标记的应用在于检测烟草基因组dna中是否存在i型烟草蔗糖酯基因qse443及待测植株中的i型烟草蔗糖酯的基因型状态。

25、本发明上述的应用，该应用的方法为，以tmc42465和tmc42467序列的引物分别扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物。

26、本发明pcr扩增产物中同时含有如seq id no.1和seq id no.3所示序列则表明该待测烟草植株含有高香气品质的i型烟草蔗糖酯的纯合等位基因，基因型为se443 se443。

27、本发明pcr扩增产物中同时含有如seq id no.2和seq id no.4所示序列则为待测烟草植株不含有高香气品质的i型烟草蔗糖酯的纯合等位基因，基因型为se443 se443。

28、本发明pcr扩增产物中同时含有如seq id no.1和seq id no.4所示序列，或同时含有如seq id no.2和seq id no.3所示序列则为待测烟草植株含有高香气品质的i型烟草蔗糖酯的杂合等位基因，基因型为se443 se443。

29、为了简捷高效选择具有高香气品质潜力的i型烟草蔗糖酯烟草品种，本发明有针对性并特异性地选择含i型烟草蔗糖酯基因qse443的后代材料，可用于i型烟草蔗糖酯基因qse443的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及高香气烟草品种选育的效率。利用本发明提供的2个与i型烟草蔗糖酯基因qse443紧密连锁的共显性ssr标记，不仅可用于定性检测任何生育期的烟草基因组dna中是否存在i型烟草蔗糖酯基因qse443，还可以清晰鉴别待测植株中的i型烟草蔗糖酯的基因型状态(即，具有最高含量值且稳定遗传的纯合基因型se443 se443、具有中等含量值且遗传不能稳定的杂合基因型se443 se443、不含或含痕量值且稳定遗传的纯合基因型se443 se443)，进而既提高了具有高香气品质烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。

30、本发明与现有技术相比，其有益效果为：

31、1、填补了国内外关于不含3-甲基戊酰的i型烟草蔗糖酯基因qse443遗传与定位研究的空白。

32、2、纠正了现有技术的错误

33、本发明有效纠正并弥补了文献中将六种不同类型烟草蔗糖酯基因视作一个基因(bmvse)的错误与不足，同时也可精准的鉴别具有i型烟草蔗糖酯的基因型。

34、3、检测i型烟草蔗糖酯准确度高

35、提供了用于检测i型烟草蔗糖酯基因qse443的分子标记，可精准确定待测烟草中是否含有i型烟草蔗糖酯，与现有技术检测烟草蔗糖酯含量的方法相比，本方法的检测准确度更高。

36、4、检测方法高效、稳定、可靠，且操作简捷和低成本

37、与现有的采用低通量、高成本、耗时费力的gc-ms法检测成熟期烟草蔗糖酯含量相比，本发明所述的共显性ssr标记具有高效、稳定、可靠、简捷和低成本的特点。

38、5、不限检测时机

39、本方法可在烟草生长的任何时期进行检测，极大的缩短了实验周期，进而加速了选育高香气品质烤烟新品种进程。

40、下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。