本氏烟草NbSRM2基因工程载体及其构建方法和应用

本发明属于基因工程技术，尤其涉及到一种本氏烟草nbsrm2基因工程载体及其构建方法和应用。

背景技术：

1、叶片是植物利用光能合成有机化合物的重要场所，衰老是叶片发育的最后一个阶段。种子萌发对植物完成正常的生命周期至关重要，发芽率是衡量种子质量的一个重要指标，发芽率高的种子能够有效地提高作物的出苗率、增加生长发育速度，使作物在生长期间更加强壮健康，从而提高作物产量。另外，发芽率高的种子能够减少生产成本，降低播种量，减少浪费，节省种子使用量，降低生产成本。

2、烟草作为我国重要的经济作物之一。烟叶衰老直接影响烟草叶片落黄进度，进而影响烟草产品产量、品质及经济收益。因此利用现代基因工程手段改造烟草基因，获得烟草叶片落黄可控的植物材料是提高烟叶品质的重要手段。另外，烟草叶片落黄直接影响叶片后期烘烤工艺，对烟叶香气物质的形成具有重要影响。本氏烟草作为栽培烟草的近缘物种，其基因对于栽培烟草同样有效。另外，在烟草生物反应器应用中，叶绿体转化是一种高效表达外源蛋白的方法，本氏烟草的叶绿体转化技术体系最为成熟，而其中关键影响因素就是烟草本身所含有的叶绿体的稳定性，不易降解。因此，研究本氏烟草叶绿体降解、叶片衰老对叶绿体工程应用极为关键。在现代作物品种选育过程中，育种家追求种子萌发的更快速、更整齐，种子萌发异常会导致穗发芽，影响粮食生产和食品安全。因此，种子萌发对保障作物的增产稳产和食品安全具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明提供了一种本氏烟草nbsrm2基因工程载体及其构建方法和应用，该方法通过过表达或基因编辑技术，创制nb srm2基因表达异常材料，发现其可显著促进烟草叶片落黄，降低种子萌发效率，该基因可作为控制烟草叶片落黄进程的关键基因作为调控种子萌发的基因资源加以利用。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种本氏烟草nbsrm2基因在调控叶绿素降解及促进种子萌发中的应用，所述本氏烟草nb srm2基因为其过表达载体，核苷酸序列如seq idno：1所示，或为其基因编辑载体，核苷酸序列如seq id no：3所示。

3、本发明还提供了一种制备可调控叶片叶绿素降解及促进种子萌发的转基因烟草植物的方法，通过对本氏烟草nb srm2基因进行过表达，利用叶盘法转化本氏烟草叶片，获得再生苗后对其初步抗性筛选，获得阳性转基因材料，从而获得可调控叶片叶绿素降解及种子萌发的转基因烟草植物，所述本氏烟草nb srm2基因为其过表达载体，核苷酸序列如seq id no：1所示，或为其基因编辑载体，核苷酸序列如seq id no：3所示。

4、本发明提供了一种本氏烟草nb srm2基因过表达载体的构建方法，包括以下步骤：

5、设计可用于gateway连接系统的nb srm2基因特异性引物nb srm2-gf和nb srm2-gr；

6、提取本氏烟草总rna，利用试剂盒将其反转录为cdna，其序列如seq id no：2所示，然后利用上述特异性引物nb srm2-gf和nb srm2-gr进行退火梯度降落pcr扩增；

7、合成gateway扩增引物，以上述退火梯度降落pcr扩增产物稀释50倍为模板，进行普通pcr扩增；

8、将pcr产物回收纯化，通过gateway试剂盒连接到中间载体pzero上，连接后，将连接产物通过化学转化方法转入大肠杆菌dh5a，测序，选择测序正确的克隆提取质粒，命名为nb srm2-pzero载体；

9、然后通过lr反应将nb srm2-pzero载体连入最终过表达载体pearlygate202中，连接后，鉴定提取过表达载体的阳性质粒，得到本氏烟草nb srm2基因过表达载体，其序列如seq id no：1所示。

10、作为优选，所述特异性引物nb srm2-gf的序列如seq id no：5所示；nb srm2-gr的序列如seq id no：6所示。

11、作为优选，所述退火梯度降落扩增程序为：

12、step 1：95℃3min；

13、step 2：95℃30s，72℃15s，72℃30s；2个循环；

14、setp3：95℃30s，68℃15s，72℃30s；2个循环；

15、step 4：95℃30s，66℃15s，72℃30s；4个循环；

16、step 5：95℃30s，64℃15s，72℃30s；4个循环；

17、sept6：95℃30s，60℃15s，72℃30s；3个循环；

18、step 7：95℃30s，56℃15s，72℃30s；24个循环；

19、step 8：72 5min。

20、作为优选，所述普通pcr扩增程序为：

21、step 1：98℃2min；

22、step 2：98℃15s，56℃15s，72℃30min；35个循环；

23、setp 3：72℃5min。

24、作为优选，在通过gateway试剂盒连接到中间载体pzero步骤中，连接体系为：pzero载体1μl，纯化后的pcr片段3μl，bp酶1μl，于25℃过夜连接。

25、作为优选，在通过lr反应将nb srm2-pzero载体连入最终过表达载体pearlygate202步骤中，反应体系为：nb srm2-pzero载体2μl，pearlygate202载体2μl，lr酶1μl，于25℃过夜连接。

26、本发明还提供了一种本氏烟草nb srm2基因的基因编辑载体的构建方法，包括以下步骤：

27、选取针对nb srm2基因的目标序列合成nb srm2基因编辑合成序列，其序列如seqid no：4所示；

28、设计含有接头的引物nb srm2-cri-f和nb srm2-cri-r，并以上述合成序列为模板，对seq id no：4所示的基因编辑片段进行扩增，获得pcr片段，命名为nb srm2-cri；

29、将上述所得pcr片段通过infusion技术连接到基因编辑载体1300-cri上，连接后，讲连接产物转化到大肠杆菌dh5a，鉴定提取编辑载体的阳性质粒，得到本氏烟草nb srm2基因的基因编辑载体，其序列如seq id no：3所示。

30、作为优选，所述方法中所用序列如下：

31、nb srm2基因的目标序列：ctcttcatggcgaaggtcgttgg，其中tgg为pam序列：

32、nb srm2-cri-f：

33、gatcggaagcttaggttactttaaattttttcttatgcag；

34、nb srm2-cri-r：

35、ggcaacgcgttctaggcaccgactcggtgccact。

36、作为优选，所述infusion技术的反应体系为：nb srm2-cri片段2μl，基因编辑载体1300-cri 2μl，infusion酶mix：1μl；反应条件为：50℃，反应15分钟。

37、作为优选，所述普通pcr扩增程序为：

38、step 1：98℃2min；

39、step 2：98℃15s，56℃15s，72℃30min；35个循环；

40、setp 3：72℃5min。

41、本发明还提供了一种本氏烟草nb srm2基因的工程载体，为通过权利要求上述任一项技术方案所述的构建方法构建得到的过表达载体，或为通过上述任一项技术方案所述的构建方法构建得到的基因编辑载体。

42、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

43、本发明提供了一种本氏烟草nb srm2基因过表达载体及其构建方法和应用，通过过表达或基因编辑技术，创制nb srm2基因表达异常材料，发现其可显著促进烟草叶片落黄，降低种子萌发效率。因此，nb srm2基因能够作为控制烟草叶片落黄进程的关键基因并应用于相关基因工程，具有重要应用潜力，同时该基因可作为调控种子萌发的基因资源加以利用。