m6A甲基转移酶复合物相关基因的siRNA及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及m6a甲基转移酶复合物相关基因的sirna及其应用。

背景技术：

1、m6a(6-甲基腺嘌呤，n6-methyladenosine)甲基化，即在rna腺苷酸(a)第六位的n上发生甲基化修饰，是真核生物rna中最常见的一种转录后修饰，约占rna甲基化修饰的80％左右。

2、m6a rna甲基化是一个动态可逆的修饰过程，该过程需要在m6a甲基转移酶复合物(编码器，writers)、m6a去甲基化酶(消码器，erasers)和m6a读取蛋白(读码器，readers)的参与下催化形成。

3、m6a甲基转移酶复合物(编码器，writers)以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，催化rna上的m6a甲基化修饰形成，主要组分有甲基转移酶样蛋白3(mettl3)、甲基转移酶样蛋白14(mettl14)、wilms肿瘤1相关蛋白(wtap)、rna结合基序蛋白15(rbm15)、rna结合基序蛋白15b(rbm15b)及病毒样m6a转移酶相关蛋白(virma或kiaa1429)等。

4、mettl3是第一个发现的甲基转移酶，为该复合体的核心亚基，起主要的催化作用。mettl14本身不具有甲基转移能力，但能与mettl3以1:1的比例结合，形成稳定的异源二聚体，作为rna结合支架，变构激活并增强mettl3催化活性。wtap具有稳定核心复合物的功能，可以促进mettl3-mettl14复合物定位于富含mrna剪切因子和出核转运因子的核小斑。rbm15、rbm15b、kiaa1429也是m6a甲基转移酶复合物的组成部分，结合并募集复合物至特定位点，影响甲基化修饰过程。

5、m6a甲基化修饰主要在mrna前体的剪接、3’端加工、核输出、翻译调节、mrna衰变、mrna的稳定性、环状rna翻译和mirna加工等多个过程中发挥作用，其动态可逆的变化控制对细胞的生长和分化具有重要的调节作用，使得m6a及修饰蛋白的异常在多种重大疾病的发生过程中扮演重要角色。例如，以mettl3和mettl14为主的m6a编码器发挥着促进肿瘤细胞生长、存活和侵袭的作用；mettl3高表达促进包括肝癌、乳腺癌及膀胱癌在内的多种癌症的发生发展；m6a甲基化可以调控造血干细胞定向分化、调控精子发生等。然而目前并没有针对m6a甲基转移酶的靶向治疗药物，因此，开发针对m6a甲基转移酶相关基因靶点的药物尤为迫切。

6、sirna(小干扰rna)是一段与靶基因序列同源的、长度在20-25nt的双链rna，可以特异性地引起具有相同序列的mrna的降解，从而阻断相应基因的表达，进而治疗该基因引起的各类疾病。

7、现有的技术中，目前并没有针对m6a甲基转移酶的靶向治疗药物，本发明针对m6a甲基转移酶相关基因设计sirna并有效干扰基因表达，有望突破m6a甲基转移酶相关基因引起的疾病治疗方面的瓶颈。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供m6a甲基转移酶复合物相关基因的sirna及其应用，其针对m6a甲基转移酶设计特异性sirna作为靶向治疗药物，sirna寡聚核酸组合可以有效抑制包含mettl3、mettl14、wtap、rbm15、rbm15b、kiaa1429在内的甲基转移酶的表达，抑制其生物学功能的发挥。

2、本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

3、m6a甲基转移酶复合物相关基因的sirna，包含mettl3、mettl14、wtap、rbm15、rbm15b、kiaa1429在内的甲基转移酶的sirna寡聚核酸组合。

4、作为本发明的进一步的技术方案：所述sirna为一种核酸分子，包括gp-mettl3-6、gp-mettl3-8、gp-mettl14-2、gp-mettl14-4、gp-mettl14-6、gp-mettl14-8、gp-wtap-1、gp-wtap-2、gp-wtap-3、gp-wtap-4、gp-rbm15-10、gp-rbm15b-3、gp-kiaa1429-1、gp-kiaa1429-3、gp-kiaa1429-5、gp-kiaa1429-6。

5、作为本发明的进一步的技术方案：所述核酸分子为双链rna分子。

6、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-mettl3-6由如下序列的正义链和反义链组成：

7、正义链：5’-gauugaguuauuuggacgatt-3’，

8、反义链：5’-ucguccaaauaacucaauctt-3’；

9、所述gp-mettl3-8由如下序列的正义链和反义链组成：

10、正义链：5’-caguggaucuguugugauatt-3’，

11、反义链：5’-uaucacaacagauccacugtt-3’。

12、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-mettl14-2由如下序列的正义链和反义链组成：

13、正义链：5’-guuuagcugacagauuugatt-3’，

14、反义链：5’-ucaaaucugucagcuaaactt-3’；

15、所述gp-mettl14-4由如下序列的正义链和反义链组成：

16、正义链：5’-ggacuucauucaugcuaautt-3’，

17、反义链：5’-auuagcaugaaugaagucctt-3’；

18、所述gp-mettl14-6由如下序列的正义链和反义链组成：

19、正义链：5’-agauaaggaaugagugauatt-3’，

20、反义链：5’-uaucacucauuccuuaucutt-3’；

21、所述gp-mettl14-8由如下序列的正义链和反义链组成：

22、正义链：5’-gggaugauauuaugaaguutt-3’，

23、反义链：5’-aacuucauaauaucauccctt-3’。

24、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-wtap-1由如下序列的正义链和反义链组成：

25、正义链：5’-gugaacuggaacagacuaatt-3’，

26、反义链：5’-uuagucuguuccaguucactt-3’；

27、所述gp-wtap-2由如下序列的正义链和反义链组成：

28、正义链：5’-cuggaaguuuacgccugautt-3’，

29、反义链：5’-aucaggcguaaacuuccagtt-3’；

30、所述gp-wtap-3由如下序列的正义链和反义链组成：

31、正义链：5’-cugagugccuggaaguuuatt-3’，

32、反义链：5’-uaaacuuccaggcacucagtt-3’；

33、所述gp-wtap-4由如下序列的正义链和反义链组成：

34、正义链：5’-ggaacagacuaaagacaaatt-3’，

35、反义链：5’-uuugucuuuagucuguucctt-3’。

36、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-rbm15-10由如下序列的正义链和反义链组成：

37、正义链：5’-guacacaagauuucuggaatt-3’，

38、反义链：5’-uuccagaaaucuuguguactt-3’。

39、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-rbm15b-3由如下序列的正义链和反义链组成：

40、正义链：5’-ccacgucuaugcauauccutt-3’，

41、反义链：5’-aggauaugcauagacguggtt-3’。

42、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-kiaa1429-1由如下序列的正义链和反义链组成：

43、正义链：5’-gaagccuggaauaugaugatt-3’，

44、反义链：5’-ucaucauauuccaggcuuctt-3’；

45、所述gp-kiaa1429-3由如下序列的正义链和反义链组成：

46、正义链：5’-ggaagaaggugaagaggautt-3’，

47、反义链：5’-auccucuucaccuucuucctt-3’；

48、所述gp-kiaa1429-5由如下序列的正义链和反义链组成：

49、正义链：5’-ggaucaagguccagauaaatt-3’，

50、反义链：5’-uuuaucuggaccuugaucctt-3’；

51、所述gp-kiaa1429-6由如下序列的正义链和反义链组成：

52、正义链：5’-gaagucaguagcuuauaautt-3’，

53、反义链：5’-auuauaagcuacugacuuctt-3’。

54、如上述的m6a甲基转移酶复合物相关基因的sirna在m6a甲基转移酶相关基因引起的疾病治疗方面的应用。

55、如上述的m6a甲基转基酶复合物相关基因的sirna的检测试剂盒，包含mettl3、mettl14、wtap、rbm15、rbm15b、kiaa1429的引物。

56、作为本发明的进一步的技术方案：所述mettl3由如下序列的上游引物和下游引物组成：

57、上游引物：5’-gggaccctgacagatgatgag-3’，

58、下游引物：5’-tccgaatgatgcgttgca-3’；

59、所述mettl14由如下序列的上游引物和下游引物组成：

60、上游引物：5’-agacactggacatagacctcaga-3’，

61、下游引物：5’-cctttagcctgatgagctccc-3’；

62、所述wtap由如下序列的上游引物和下游引物组成：

63、上游引物：5’-ggaagtttacgcctgatagcc-3’，

64、下游引物：5’-tcaagttgtgcaatacgtccct-3’；

65、所述rbm15由如下序列的上游引物和下游引物组成：

66、上游引物：5’-tggtcatgatcattgtccgtg-3’，

67、下游引物：5’-gtcagcgccaagttttctctc-3’；

68、所述rbm15b由如下序列的上游引物和下游引物组成：

69、上游引物：5’-aaagaccacacttctgggagc-3’，

70、下游引物：5’-ttgatgcgtcgtgtgacct-3’；

71、所述kiaa1429由如下序列的上游引物和下游引物组成：

72、上游引物：5’-ctggagtcatcaggtgaccctt-3’，

73、下游引物：5’-catcagcaagcacataggcagt-3’。

74、如上述的m6a甲基转移酶复合物相关基因的sirna在检测试剂盒方面的应用。

75、综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

76、本发明公开了一种m6a甲基转移酶复合物相关基因的sirna及其应用，其针对m6a甲基转移酶设计特异性sirna作为靶向治疗药物，sirna寡聚核酸组合可以有效抑制包含mettl3、mettl14、wtap、rbm15、rbm15b、kiaa1429在内的甲基转移酶的表达，抑制其生物学功能的发挥。