抗小鼠DR5的单克隆抗体及其制备方法和应用

本发明属于生物医学，具体涉及抗小鼠dr5的单克隆抗体1b5及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis-factor related apoptosis-inducing ligand,trail)是肿瘤坏死因子超家族的一员，1995年由wiley等人首次发现，其可在对正常细胞相对安全的情况下选择性地杀伤肿瘤细胞。trail可与其受体，即死亡受体4(death receptor4，dr4)或死亡受体5(death receptor 5，dr5)结合，形成一种膜结合型大分子复合体——死亡信号诱导复合体(death-inducing signaling complex,disc)诱导细胞凋亡。虽然dr4与dr5均可与trail结合诱导细胞凋亡，但dr5与trail的亲和力更高且被普遍认为是更有效的凋亡诱导因子。

2、trail/dr5通路参与许多疾病的发展过程，如癌症、缺血再灌注损伤、瘢痕疙瘩、狼疮肾炎等，激动或阻断trail/dr5通路在这些疾病治疗研究中发挥了重要的作用。本发明的发明人课题组之前的研究表明，在猴、猪及大鼠心梗模型中，可溶性dr5-fc融合蛋白(sdr5-fc)可竞争性结合trail阻断trail/dr5通路从而减轻心肌缺血再灌注损伤，为了进一步完善trail/dr5通路在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中的研究，需要相应的抗体进行免疫分析检测。

3、人和小鼠dr5蛋白具有高度同源性，目前市面上的dr5抗体大多是以dr5死亡结构域中的一段序列所制备的多肽作为免疫原，因物种间死亡结构域的高同源性，这些抗体通常可同时用于人、大鼠和小鼠的免疫实验中。虽能满足大多数实验需求，但该类抗体无法识别dr5胞外段。少数以人dr5胞外段为免疫原所制备的单克隆抗体只能识别人源dr5蛋白且适用的免疫实验较为局限。可识别小鼠dr5胞外段的单克隆抗体也存在应用局限的问题，该类抗体无法应用于western blot等实验。

4、小鼠模型是研究trail/dr5通路的重要手段，小鼠dr5胞外段相关抗体的缺乏阻碍了对trail/dr5通路的进一步研究。由此，本发明的发明人通过免疫大鼠制备得到了抗小鼠dr5单克隆抗体，以期为trail/dr5通路相关疾病研究提供更多检测工具，同时钓取抗体可变区序列为获得更加可靠且稳定的抗体来源奠定基础。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供抗小鼠dr5的单克隆抗体及其制备方法和应用，所述单克隆抗体为1b5，其包含如seq id no:7所示的重链可变区中的hcdr1-3、如seq idno:15所示的轻链可变区中的lcdr1-3。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明的第一方面提供了一种抗小鼠dr5的单克隆抗体。

4、进一步，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如seq id no:7所示的重链可变区中的hcdr1-3，所述轻链可变区包含如seq id no:15所示的轻链可变区中的lcdr1-3。

5、进一步，所述hcdr1、hcdr2、hcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3所示或分别如seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6所示；

6、优选地，所述lcdr1、lcdr2、lcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11所示或分别如seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14所示。

7、进一步，所述重链可变区包含与seq id no:7具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列；

8、优选地，所述轻链可变区包含与seq id no:15具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。

9、在本发明中，所述同一性是指一定程度的互补性。可以是部分同源、基本同源或完全同源。基本同源是指至少部分抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列。可在低严谨性条件下使用杂交实验(southern或northern印迹，溶液杂交等)检验对完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本同源的序列或杂交探针在低严谨性条件下将竞争并抑制完全同源序列与靶序列的结合。这并不是说低严谨性条件允许非特异性结合；低严谨性条件需要两条序列的相互结合是特异性(选择性)相互作用。

10、在某些实施方案中，本发明所述hcdr1-3、lcdr1-3对应的氨基酸序列并不局限于本发明具体列举出的序列，采用任何cdr编号方案(现有的cdr编号方案或将来产生的新的cdr编号方案)分别对如seq id no:7所示的重链可变区中的hcdr1-3进行定义、对如seq idno:15所示的轻链可变区中的lcdr1-3进行定义得到的hcdr1-3、lcdr1-3对应的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列均落入本发明的保护范围。

11、在具体实施方案中，所述hcdr1-3、lcdr1-3是根据imgt编号方案、kabat编号方案、chothia编号方案、martin(增强型chothia)编号方案、abm编号方案、aho编号方案、contact编号方案中的任意一种对如seq id no:7所示的重链可变区和如seq id no:15所示的轻链可变区进行定义或任意多种(两种或两种以上)组合对如seq id no:7所示的重链可变区和如seq id no:15所示的轻链可变区进行定义得到的，经上述定义方式定义得到的hcdr1-3、lcdr1-3对应的抗体的序列包含在本发明的保护范围内。

12、本发明的第二方面提供了一种双特异性抗体。

13、进一步，所述双特异性抗体包含本发明第一方面所述的单克隆抗体；

14、优选地，所述双特异性抗体还包含一个与其它抗原特异性结合的第二抗体。

15、在本发明中，所述双特异性抗体是指具有由不同的抗体序列限定的两个不同抗原结合区域的抗体。可以理解为与不同的靶标结合，但也包括与一个靶标的不同表位相结合。其包括全长双特异性抗体及其抗原结合片段。双特异性抗体可以含有另外的修饰，如非天然存在的氨基酸、fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。双特异性抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出期望的生物活性，其均属于所述双特异性抗体的范畴。

16、本发明的第三方面提供了一种分离的多核苷酸。

17、进一步，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体；

18、优选地，编码本发明第一方面所述单克隆抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seq id no:8所示；

19、优选地，编码本发明第一方面所述单克隆抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如seq id no:16所示。

20、在某些实施方案中，所述多核苷酸包括单链和双链核苷酸聚合物。多核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，例如：溴尿苷和肌苷衍生物、核糖修饰如2’,3’-二脱氧核糖、核苷酸间键修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯和氨基磷酸酯。

21、本发明的第四方面提供了一种表达载体。

22、进一步，所述表达载体包含本发明第三方面所述的多核苷酸；

23、优选地，所述载体包括病毒载体、脂质纳米粒、聚合物纳米载体、无机纳米载体、蛋白载体、外泌体；

24、更优选地，所述病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体、腺相关病毒载体。

25、在某些实施方案中，任何能够递送核酸的载体都可以适用于本发明。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、dna载体、鼠白血病病毒载体、sfg载体、质粒、rna载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、epstein barr病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体(aav)、慢病毒载体或其任何组合。

26、在具体实施方案中，合适的示例性载体包括例如：pgar、pbabe-puro、pbabe-neolargetcdna、pbabe-hygro-htert、pmko.1gfp、mscv-ires-gfp、pmscv pig(puro ires gfp空质粒)、pmscv-loxp-dsred-loxp-egfp-puro-wpre、mscv ires萤光素酶、pmig、mdh1-pgk-gfp_2.0、ttrmpvir、pmscv-ires-mcherry fp、pretrox gfp t2a cre、prxtn、plncexp和plxin-luc，但不局限于此。

27、在具体实施方案中，所述表达载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括设计用于增殖和扩增或用于表达或两者的载体，如质粒和病毒。例如，载体可以选自puc系列(fermentas lifesciences,glen burnie,md.)、pbluescript系列(stratagene,lajolla,calif.)、pet系列(novagen,madison,wis.)、pgex系列(pharmacia biotech,uppsala,sweden)和pex系列(clontech,palo alto,calif.)。也可以使用噬菌体载体，如λgt10、λgt11、λzapii(stratagene)、λembl4和λnm1149。也可以使用植物表达载体，如pbi01、pbi101.2、pbi101.3、pbi121和pbin19(clontech)。

28、本发明的第五方面提供了一种宿主细胞。

29、进一步，所述宿主细胞包含本发明第三方面所述的多核苷酸或本发明第四方面所述的表达载体；

30、优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、真菌细胞、酵母细胞、高等真核细胞；

31、更优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

32、在某些实施方案中，任何能够将所述表达载体引入其中的细胞都可以适用于本发明。在一些实施方案中，细胞可以是原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞如哺乳动物细胞。合适的原核细胞包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(enterobactehaceae)，如埃希氏杆菌属(escherichia)，例如大肠杆菌(e.coli)；肠杆菌属(enterobacter)；欧文氏菌属(erwinia)；克雷伯氏菌属(klebsiella)；变形杆菌属(proteus)；沙门氏菌属(salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)；沙雷氏菌属(serratia)，例如粘质沙雷氏菌(serratia marcescans)和志贺氏菌(shigella)；杆菌属(bacilli)，如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)；假单胞菌属(pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)；和链霉菌属(streptomyces)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括例如cho细胞，如chos细胞和cho-k1细胞，或hek293细胞，如hek293a、hek293t和hek293fs，但不局限于此。

33、本发明的第六方面提供了如下任一种物质，所述物质包括：

34、(1)一种检测试剂，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的单克隆抗体和/或本发明第二方面所述的双特异性抗体；

35、(2)一种检测产品，所述检测产品包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体和/或所述检测试剂；

36、优选地，所述检测产品包含检测试剂盒、检测试纸条、检测芯片；

37、(3)一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体和/或本发明第二方面所述的双特异性抗体。

38、进一步，所述检测试剂或检测产品中还可包含其它能够用于辅助检测dr5蛋白的试剂，本领域技术人员能够根据实际需要在所述检测试剂或检测产品中添加一种或多种能够用于辅助检测dr5蛋白的试剂，基于此制备得到的检测试剂或检测产品同样包含在本发明的保护范围内。在一些实施方案中，本发明所述的检测试剂、检测产品(例如检测试剂盒、检测试纸条、检测芯片)用于检测待测样品中的dr5蛋白，以获得待测样品中dr5蛋白的定性和/或定量检测结果。

39、在某些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂旨在包括与药物有效成分施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类载剂或赋形剂的优选实例包括但不限于：水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水媒介物如不挥发油。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于组合物中。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。

40、本发明的第七方面提供了如下任一种方法，所述方法包括：

41、(1)一种生产本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括如下步骤：对本发明第五方面所述的宿主细胞进行培养得到培养产物，从培养产物中分离纯化得到本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体；

42、(2)一种制备本发明第五方面所述的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体引入到宿主细胞中，得到本发明第五方面所述的宿主细胞；

43、(3)一种非诊断目的地检测待测样品中dr5蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第六方面中所述的检测试剂与待测样品接触，检测dr5蛋白与所述单克隆抗体免疫复合物的形成。

44、此外，本发明还提供了一种用于诊断dr5表达相关疾病的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第六方面中所述的检测试剂或检测产品与受试者来源的待测样品接触，检测受试者来源的待测样品中dr5蛋白的定性或定量检测结果。

45、此外，本发明还提供了一种用于治疗dr5表达相关疾病的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体和/或本发明第六方面中所述的药物组合物。

46、在本发明中，所述受试者是指期望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者。用于治疗目的的哺乳动物是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜、以及实验室、动物园或宠物动物，如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等。

47、在本发明中，所述治疗可以包括治疗哺乳动物，特别是人的疾病或病症(例如dr5表达相关疾病)，并且包括：(a)在可能易感dr5表达相关疾病而尚未被诊断患病的受试者中预防疾病或疾病症状的发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)缓解疾病，即导致疾病的消退。治疗可以指在所述疾病的治疗或改善或预防中的任何成功指标，包括任何客观或主观参数，如症状的减少；缓解；消除疾病症状或使疾病病症对患者更容易忍受；减慢恶化或衰退速度；或使恶化的最后节点衰弱减少。症状的治疗或改善基于一个或多个客观或主观参数；包括医生检查的结果。因此，所述治疗包括本文公开的抗体或药物组合物的施用，以预防或延迟、缓解、或阻止或抑制与疾病相关的症状或病症的发展。

48、本发明的第八方面提供了如下任一种应用，所述应用包括：

49、(1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明第五方面所述的宿主细胞在制备用于检测dr5蛋白的检测试剂中的应用；

50、(2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面中所述的检测试剂在制备用于检测dr5蛋白的检测产品中的应用；

51、(3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面中所述的检测试剂或检测产品在制备用于诊断和/或辅助诊断dr5表达相关疾病的产品中的应用；

52、(4)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面中所述的检测试剂或检测产品在非诊断目的地检测dr5蛋白中的应用；

53、(5)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明第五方面所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防dr5表达相关疾病的药物组合物中的应用。

54、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：

55、本发明提供了一种全新的抗小鼠dr5的单克隆抗体1b5及其相关检测产品，经实验验证发现，所述单克隆抗体1b5能够特异性结合dr5，且具有较好的特异性、亲和力和灵敏度，为后续dr5相关的检测试剂盒的研发奠定了基础，具有良好的应用前景。