本申请涉及动物实验，尤其涉及一种基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法。
背景技术：
1、动物试验指在试验室内，为了获得有关生物学、医学等方面的新知识或解决具体问题而使用动物进行的科学研究。在生物医学研究中，临床前动物试验有着至关重要的意义，通过对动物(如猴、狗、兔等)进行研究，模拟人类生理特点，为评估药品、医疗器械等在人体上的效果、安全性和可行性提供重要依据。
2、而构建动物皮肤模型的动物试验，是以研究目标物质对皮肤刺激性和皮肤过敏性为主要目的动物试验；在化妆品、外用药物、功能性敷料等相关领域的研发中，具有重要的意义。目前现行的皮肤刺激性和皮肤过敏性动物试验研究，主要以兔为试验动物，通过目测是否产生红肿和/或红斑，采用评分机制来判断对应物质的皮肤刺激性和皮肤过敏性。我国现行的国家标准gb/t 16886.10-2017《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验》对上述动物试验有着十分明确的方法和相关规定要求的记载。相关的动物试验需要采用兔为试验动物，以整体动物试验的方式进行。
3、然而，上述整体动物试验对动物需求数量多、采用中大型动物成本较高、试验周期长，还存在动物伦理问题。此外，上述整体动物试验的评分体制仅包括红肿和红斑的肉眼观测，无法探索目标物质对皮肤刺激和/或致敏的致病机制；因而无法确切的对目标物质的安全剂量、相关安全指标等进行有效的研究。本领域目前急需一种能够有效的探究目标物质对皮肤刺激和/或致敏的致病机制的动物试验方法，解决上述问题。
技术实现思路
1、为了解决上述至少一种技术问题，开发一种能够使用小鼠作为试验动物，仅用少量小鼠就能对皮肤刺激和/或致敏进行试验研究，并且还能够针对致病机制进行试验研究的试验方法，本申请提供一种基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法。
2、一方面，本申请提供了一种基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，包括以下步骤：
3、s1、取小鼠，去除背颈部毛发，按照动物试验标准分组，并构建所需试验目标物的动物皮肤模型；
4、s2、取步骤s1得到的动物试验小鼠的试验部位的皮肤组织，按照试验分组提取每组小鼠的皮肤总rna，并逆转录合成cdna；
5、s3、根据病理学原理，按照目标物至皮肤刺激和/或皮肤致敏的影响因素，选择需检测的分子靶点；
6、s4、按照试验分组，取步骤s2提取的小鼠的皮肤总rna，纯化处理后，按单周期目标标记法合成并标记crna后，与基因表达芯片杂交；用微阵列芯片扫描设备扫描杂交后的基因表达芯片，经软件处理分析，筛选出表达差异基因，以及得出基因表达谱数据；
7、s5、采用qpcr法，按照试验分组，分别检测步骤s2得到的cdna中，经步骤s4筛选的表达差异基因的表达，得出表达结果。
8、可选的，所述步骤s2中，所述提取每组小鼠的皮肤总rna，采用总rna提取试剂盒提取，依据总rna提取试剂盒的说明书操作。
9、可选的，所述步骤s2中，所述逆转录程序为25℃下5分钟，42℃下30分钟，85℃下5分钟。
10、可选的，所述步骤s4中，所述基因表达芯片采用安捷伦基因表达芯片，所述软件处理分析采用安捷伦特征提取软件。
11、可选的，所述步骤s5中，所述qpcr的扩增条件为95℃预变性30秒，然后40个循环的循环扩增。
12、进一步可选的，所述步骤s5中，单个循环扩增程序为在95℃变性15秒，60℃退火30秒。
13、可选的，所述步骤s1中，所需试验目标物为纳米二氧化钛，选择spf级icr小鼠为试验小鼠，试验分组包括空白组，每组16只小鼠。
14、进一步可选的，所述步骤s3中，选择ctsl、mta1、trp53、fos、sry-box2、nanog、kmt2d、il-1β、il-6和tnf-α这10个分子标靶。
15、进一步可选的，所述步骤s5中，所述基因表达芯片选择安捷伦基因表达芯片；与基因表达芯片杂交采用55℃温度下，杂交18小时的方式进行。
16、另一方面，本申请还提供了上述的基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，在外用药物、外用医疗器械和外用涂覆类产品研发领域的应用。
17、综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
18、1.本申请设计了一种基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，采用了与现有动物皮肤模型完全不同的检测思路，通过检测依据病理学原理选择的分子靶点的表达，得出目标物质对皮肤刺激和/或皮肤致敏的影响结论；相比于现有技术采用的构建动物模型后的肉眼观测是否存在红肿情况，本申请的测定结果更为精确，也更为灵敏和可观。
19、2.本申请采用分子靶点的表达测定，来进行皮肤刺激和/或皮肤致敏试验，采用小鼠作为试验动物，构建动物模型后，即可进行相关的测定，试验周期较短；相比于现有技术的试验方法，本申请无需采用中、大型动物，无需喂养至动物皮肤出现红肿，而且无需在试验动物未出现皮肤症状后进行多批次的反复试验，整体成本大幅降低。
20、3.本申请采用分子靶点的表达测定，同时采用qpcr法和基因表达芯片检测这两种检测方式进行测定，不但能够保证测定结果的客观、有效，同时还能获得致病机制方面的相关检测结果，能够更有助于后续研究。
1.一种基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，所述步骤s2中，所述提取每组小鼠的皮肤总rna，采用总rna提取试剂盒提取，依据总rna提取试剂盒的说明书操作。
3.根据权利要求1所述的基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，所述步骤s2中，所述逆转录程序为25℃下5分钟，42℃下30分钟，85℃下5分钟。
4.根据权利要求1所述的基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，所述步骤s4中，所述基因表达芯片采用安捷伦基因表达芯片，所述软件处理分析采用安捷伦特征提取软件。
5.根据权利要求1所述的基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，所述步骤s5中，所述qpcr的扩增条件为95℃预变性30秒，然后40个循环的循环扩增。
6.根据权利要求4所述的基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，所述步骤s5中，单个循环扩增程序为在95℃变性15秒，60℃退火30秒。
7.根据权利要求1所述的基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，所述步骤s1中，所需试验目标物为纳米二氧化钛，选择spf级icr小鼠为试验小鼠，试验分组包括空白组，每组16只小鼠。
8.根据权利要求7所述的基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，所述步骤s3中，选择ctsl、mta1、trp53、fos、sry-box2、nanog、kmt2d、il-1β、il-6和tnf-α这10个分子标靶。
9.根据权利要求8所述的基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，所述步骤s4中，所述基因表达芯片选择安捷伦基因表达芯片；与基因表达芯片杂交采用55℃温度下，杂交18小时的方式进行。
10.如权利要求1～9任意一项所述的基于测定分子靶点表达的动物皮肤模型评价方法，在外用药物、外用医疗器械和外用涂覆类产品研发领域的应用。