一种定向合成高乳化活性和抑菌活性Surfactin同系物的方法

本发明属于基因工程及微生物发酵生产领域，具体涉及一种定向合成高乳化活性和抑菌活性surfactin同系物的方法。

背景技术：

1、生物表面活性素(surfactin)是枯草芽孢杆菌的次级代谢产物，其结构是由一个七肽链(l-glu-l-leu-d-leu-l-val-l-asp-d-leu-l-leu)和一个c13～c15的β-羟基脂肪酸链组成的环状脂肽。由于氨基酸的种类、位置和脂肪酸链的长度不同，surfactin存在很多同系物组分，从而导致抗菌、溶血活性、乳化活性等性质不同。研究表明c13-surfactin和c14-surfactin具有优异的发泡和乳化性能，具有更广泛的日化护理应用前景；而c15-surfactin表现出超强的表面活性，比传统的化学表面活性剂十二烷基磺酸钠(sds)高1000多倍，抗菌、抗病毒以及溶血活性也更高，具有更广泛的医药应用、环境修复和采油应用前景。

2、目前，改变surfactin同系物组分占比的方法主要是通过改变培养基中组分氨基酸和脂肪酸组分来实现，如现有文献(朱玲燕,刘强,刘洋等.培养基组分对枯草芽胞杆菌产表面活性素的影响[j].生物加工过程,2015,13(05):8-13)公开了对枯草芽胞杆菌bs-37发酵培养基的ph、碳源、氮源、碳氮比、金属离子以及氨基酸等参数优化，提高了c15-surfactin组分的占比，可达68％；如现有文献(ding l,guo w,chen x.exogenousaddition of alkanoic acids enhanced production of antifungal lipopeptides inbacillus amyloliquefaciens pc3.appl microbiol biotechnol.2019 jul；103(13):5367-5377)报道了在bacillus amyloliquefaciens pc3生长培养基中添加十七烷酸可使表面活性素c15组分的产量增加1.83倍，达到20％～30％。此外，分子改造方面，如现有文献(dhali d,coutte f,arias aa,auger s,bidnenko v,chataignég,lalk m,niehren j,desousa j,versari c,jacques p.genetic engineering of the branched fatty acidmetabolic pathway of bacillus subtilis for the overproduction of surfactinc14 isoform.biotechnol j.2017 jul；12(7))公开了敲除支链氨基酸降解途径酶lpdv基因，提高了直链c14-surfactin组分比例提高至53％。又如专利cn202011390286公开了异源表达来源于植物加州月桂umbellularia californica中偏爱中链长c14酰基的-酰基载体蛋白(acp)硫酯酶bte并强化乙偶姻脱氢酶的表达可提高基因工程菌产nc14-surfactin组分占比达55％～60％。然而，当前现有的调控策略存在组分合成靶向性不明确、操作较为繁琐、调控范围有限，不利于工业化生产和不同应用场景需求。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明通过支链氨基酸降解途径酶、谷氨酸合成代谢途径酶和氮代谢调控因子的过表达或敲除，获得高产特定surfactin同系物的基因工程菌。

2、本发明提供的第一个技术方案为一种定向合成surfactin同系物菌株的构建方法，所述方法以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)q2为出发菌株，过表达或敲除支链氨基酸降解途径酶基因、谷氨酸合成代谢途径酶基因和/或氮代谢调控因子基因，获得定向合成c14-surfactin或c15-surfactin的菌株。

3、在某些实施方式中，所述支链氨基酸降解途径酶基因包括以下任一种或多种基因：支链α-酮酸脱氢酶e1亚基基因bkdaa、支链α-酮酸脱氢酶e1亚基基因bkdab、支链α-酮酸脱氢酶e2亚基基因bkdb、支链α-酮酸脱氢酶e3亚基基因ipdv和长链脂肪酸-coa连接酶基因lcfb。

4、在某些实施方式中，所述谷氨酸合成代谢途径酶基因包括以下任一种或多种基因：谷氨酰胺合成酶基因glna和谷酰胺酰胺水解酶基因glsb。

5、在某些实施方式中，所述氮代谢调控因子基因包括以下任一种或多种基因：天冬氨酸磷酸基因rape、分泌磷酸二酯酶基因phod、碱性磷酸酶基因phob。

6、本发明提供的第二个技术方案为利用第一个技术方案所述方法构建的定向合成surfactin同系物菌株，包括定向合成c14-surfactin的基因工程菌i或定向合成c15-surfactin的基因工程菌ii，

7、所述基因工程菌i是以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)q2为宿主细胞，过表达lcfb基因，glna基因和bkdab基因，同时还敲除了glsb基因、phob基因和ipdv基因；基因工程菌i在外源添加缬氨酸的培养基中所得产物中c14-surfactin组分比例可达到85％～90％，产品功能活性与市售surfactin标准品相比，其乳化活性增强25％～11倍，溶血活性降低10％；

8、所述基因工程菌ii是以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)q2为宿主细胞，过表达rape基因和phod基因，同时还敲除了bkdaa基因、bkdab基因和bkdb基因；基因工程菌ii在外源添加2-甲基丁酸的培养基中所得产物中c15-surfactin组分比例可达到70％以上，溶血活性增强15％，抑菌活性增强1倍，能够更好满足商业化需求。

9、在某些实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)q2为宿主细胞(见专利申请202311420848.5)，所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)q2已于2023年10月07日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m:20231833，保藏地址为武汉大学。

10、在某些实施方式中，所述基因工程菌用于过表达的载体质粒为pht01质粒，用于敲除的载体质粒为pks2质粒。

11、本发明提供的第三个技术方案为一种生产surfactin同系物的方法，所述方法为将第二个技术方案所述基因工程菌i的菌株在外源添加缬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺中一种或多种营养因子的发酵培养基中发酵，制备surfactin；

12、或所述方法为将第二个技术方案所述基因工程菌ii在外源添加异丁酸、异戊酸和2-甲基丁酸中一种或多种营养因子的发酵培养基中发酵，制备surfactin。

13、在某些实施方式中，所述缬氨酸的添加量为1.0～4.0g/l，所述谷氨酸的添加量为1.0～4.0g/l，所述谷氨酰胺的添加量为1.0～4.0g/l，所述异丁酸的添加量为1.0～4.0g/l，所述异戊酸的添加量为1.0～4.0g/l，所述2-甲基丁酸的添加量为1.0～4.0g/l。

14、本发明提供的第四个技术方案为第一个技术方案所述的方法、第二个技术方案所述的基因工程菌或者第三个技术方案所述的方法在制备含c14-surfactin或c15-surfactin的产品中的应用。

15、在某些实施方式中，所述产品为化妆品、医药品或食品。

16、相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

17、(1)本发明通过支链氨基酸降解途径酶、谷氨酸合成代谢途径酶和氮代谢调控因子的过表达或敲除，获得的基因工程菌i在外源添加缬氨酸的培养基中生产surfactin，其中c14-surfactin组分比例可达到85％～90％，较枯草芽孢杆菌q2出发菌株提高了2倍。

18、(2)本发明通过支链氨基酸降解途径酶、谷氨酸合成代谢途径酶和氮代谢调控因子的过表达或敲除，获得的基因工程菌ii在外源添加2-甲基丁酸的培养基中生产surfactin，其中c15-surfactin组分比例可达到70％以上，较枯草芽孢杆菌q2出发菌株提高了2倍。

19、(3)采用本发明构建的基因工程菌i生产的surfactin产品，与市售surfactin标准品相比，针对不同油性物质其乳化活性最高可增强15倍，溶血活性降低17％，更适用于作为日化护理原料应用。

20、(4)采用本发明构建的基因工程菌ii生产的surfactin产品，与市售surfactin标准品相比，溶血活性增强了1.6倍，抑菌活性增强了1.25倍，更适用于医疗健康和农业生物防治。

21、生物保藏材料

22、枯草芽孢杆菌q2，分类命名为bacillus subtilis，已于2023年10月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号：cctcc m:20231833。