一种利用微生物通过糖质原料发酵生产肌酸的方法

本发明涉及一种利用微生物通过糖质原料发酵生产肌酸的方法，属于基因工程。

背景技术：

1、肌酸(creatine，cr)，也称n-甲基胍基乙酸，是一种氨基酸衍生物，能参与所有细胞群体的atp稳态，具有缓冲高能磷酸盐的能力。肌酸对大脑中的能量稳态至关重要，因为肌酸缺乏会导致肌酸缺乏综合征(cds)，从而导致智力迟钝和语言延迟。有证据表明，肌酸作为一种非常安全的医学及营养补充剂对多种疾病都有益处，包括肌肉萎缩、孤独症、癌症、糖尿病、代谢紊乱等。

2、肌酸是由饮食和内源性合成获得的。在脊椎动物中，肌酸的合成涉及两个阶段：1)精氨酸和甘氨酸在l-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(agat，ec：2.1.4.1)的作用下产生胍基乙酸；2)胍基乙酸和s-腺苷甲硫氨酸在胍乙酸n-甲基转移酶(gamt，ec：2.1.1.2)作用下产生肌酸。此外，可通过食用新鲜鱼类、肉类和乳制品补充肌酸，但数量很少。对于肌酸缺乏症人群来说，需要通过营养制剂额外补充。

3、目前，肌酸的工业化生产主要依靠化学方法，这些传统的化学制备方法中往往涉及剧毒的氰胺或者肌酸收率不够理想，从而具有极大的安全隐患和生产成本高的弊端，尤其对于大规模工业化生产中，剧毒物质的泄漏很容易造成人员伤亡，同时也不贴合绿色环保的潮流。出于提高经济效益与安全的目的，生产商都希望能有生物法替代化学合成法来生产肌酸，同时它作为广泛使用的食品添加剂，寻找一种生物方法替代化学方法来生产已成为一种研究热点。

技术实现思路

1、本发明提供一种可低成本且高效合成肌酸的重组菌株及其构建方法，并提供一种能够以葡萄糖为底物一步法发酵高产肌酸的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，通过筛选肌酸合成关键酶，所述重组谷氨酸棒杆菌同时过表达l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶和胍乙酸n-甲基转移酶。整合表达s-腺苷同型半胱氨酸水解酶，解除肌酸生产酶所受到的副产物sah的反馈抑制作用，同时促进sah再生底物sam。

2、本发明提供一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌过表达了actinokineospora terrae来源的l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶atagat和来源于homosapiens的胍乙酸n-甲基转移酶hsgamt；或所述重组谷氨酸棒杆菌过表达了actinokineospora terrae来源的l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶atagat、来源于homosapiens的胍乙酸n-甲基转移酶hsgamt和酿酒酵母来源的s-腺苷同型半胱氨酸水解酶sahase。

3、在本发明的一种实施方式中，所述l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶atagat的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述胍乙酸n-甲基转移酶hsgamt的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述s-腺苷同型半胱氨酸水解酶sahase的氨基酸序列如seq id no.3所示。

4、在本发明的一种实施方式中，编码所述l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶atagat的核苷酸序列如seq id no.4所示，编码所述胍乙酸n-甲基转移酶hsgamt的核苷酸序列如seqid no.5所示，编码所述s-腺苷同型半胱氨酸水解酶sahase的核苷酸序列如seq id no.6所示。

5、在本发明的一种实施方式中，采用pxmj19质粒为表达载体。

6、在本发明的一种实施方式中，采用谷氨酸棒杆菌corynebacterium glutamicumvar.cctcc ab 2021051(c.g ab2021051)、corynebacterium glutamicum atcc14067(c.gatcc14067)为表达宿主。

7、在本发明的一种实施方式中，以c.g ab2021051为肌酸的生产菌株，以pxmj19质粒为表达载体。

8、在本发明的一种实施方式中，所述s-腺苷同型半胱氨酸水解酶sahase是整合在宿主的基因组上，整合位点为假基因位点(c629_rs09275)；整合表达s-腺苷同型半胱氨酸水解酶sahase，促进sah的水解，解除其对胍乙酸n-甲基转移酶的反馈抑制作用，同时促进sah向昂贵底物sam的再生，降低外源添加的成本。

9、本发明还提供了一种发酵制备肌酸同时促进s-腺苷甲硫氨酸sam再生的方法，所述方法为，将上述任一重组谷氨酸棒杆菌发酵制备得到的。

10、在本发明的一种实施方式中，所述方法以葡萄糖为原料，利用上述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产肌酸。

11、在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将上述重组谷氨酸棒杆菌添加至种子培养基中，在30℃，220rpm条件下培养24h制备得到种子液。

12、在本发明的一种实施方式中，所述发酵条件为：将所述种子液按照8～12％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，接种10～15h后加入终浓度为0.2～0.8mm iptg，接种0～10h后加入终浓度为2～12g/l甘氨酸，发酵过程中的溶氧水平维持在30％-40％。

13、在本发明的一种实施方式中，所述发酵条件为：将上述制备得到的种子液按照10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，在30℃，220rpm条件下发酵培养60h。

14、在本发明的一种实施方式中，将种子液转接至发酵培养基进行发酵培养时，接种12h后加入iptg，终浓度为0.5mm。

15、在本发明的一种实施方式中，将种子液转接至发酵培养基进行发酵培养时，接种0～10h后加入甘氨酸，加入甘氨酸的终浓度为2～12g/l。

16、在本发明的一种实施方式中，上罐培养时，进一步地采用转速偶联溶氧及手动提高通气量的方法将发酵过程中的溶氧水平维持在30％-40％。

17、本发明还提供了上述酿酒酵母来源的s-腺苷同型半胱氨酸水解酶sahase在提高重组谷氨酸棒杆菌发酵制备肌酸同时促进底物s-腺苷甲硫氨酸sam再生中的应用，所述重组谷氨酸棒杆菌过表达了actinokineospora terrae来源的l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶atagat、来源于homo sapiens的胍乙酸n-甲基转移酶hsgamt和酿酒酵母来源的s-腺苷同型半胱氨酸水解酶sahase。

18、在本发明的一种实施方式中，所述l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶atagat的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述胍乙酸n-甲基转移酶hsgamt的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述s-腺苷同型半胱氨酸水解酶sahase的氨基酸序列如seq id no.3所示。

19、在本发明的一种实施方式中，编码所述l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶atagat的核苷酸序列如seq id no.4所示，编码所述胍乙酸n-甲基转移酶hsgamt的核苷酸序列如seqid no.5所示，编码所述s-腺苷同型半胱氨酸水解酶sahase的核苷酸序列如seq id no.6所示。

20、本发明还提供了上述重组谷氨酸棒杆菌在同时制备s-腺苷甲硫氨酸sam和肌酸，或在制备含有s-腺苷甲硫氨酸sam的产品，或在制备含有肌酸的产品中的应用。

21、在本发明的一种实施方式中，所述产品包括不限于食品、药品、保健品。

22、有益效果

23、本发明构建了一株以葡萄糖为底物一步发酵法合成肌酸的公认安全菌株c.g ab-ag-2。

24、(1)以高产精氨酸的gras菌株corynebacterium glutamicum var.cctcc ab2021051为出发菌株，筛选具有较高酶活性的肌酸合成酶和优配底盘菌株，构建具有l-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶和胍乙酸n-甲基转移酶活性的重组谷氨酸棒杆菌c.g ab-ag-1，无需添加价格昂贵的l-精氨酸、胍基乙酸为原料，能够直接利用廉价的葡萄糖为原料进行肌酸的生产，从而有效降低生产成本。

25、(2)本发明为了解除肌酸生产副产物sah对胍乙酸n-甲基转移酶的抑制作用，整合表达sah水解酶sahase，在解除反馈抑制的同时，将副产物s-腺苷同型半胱氨酸sah用于昂贵底物sam的再生，获得重组菌c.g ab-ag-2，进一步增强肌酸的生产。

26、(3)采用本发明提供的方法进行发酵罐培养时，重组菌c.g ab-ag-2发酵罐发酵液中可积累14.2g/l的肌酸，实现无精氨酸、无胍基乙酸添加，一步发酵法由葡萄糖到肌酸的直接合成。