一种羧甲基琼脂糖微球的制备方法及其产品与流程

本发明涉及一种羧甲基琼脂糖微球的制备方法及其产品，属于生化分离介质领域。

背景技术：

1、随着生物大分子工程的不断发展，蛋白质、核酸和氨基酸等分子在生物学领域有着越来越广泛的应用，因此生物大分子的分离纯化已经成为生物技术发展过程中的关键和核心。生物大分子的分离纯化主要利用生物层析技术，它具有分离效率高、灵敏度高、选择性强和生物相容性好等优点。按照分离的原理，生物层析可分为凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析以及疏水层析等技术。生物层析技术的核心是分离介质，选择合适的分离介质对生物大分子的分离纯化非常关键。

2、天然多糖具有良好的亲水性和生物相容性，与蛋白质几乎不产生非特异性结合，能够维持蛋白质的构象而不会使其失活。天然多糖类介质因其优良的性能，长期以来一直被用作生化分离介质。琼脂糖作为一种天然多糖，因其极低的非特异性吸附和优良的亲水性而广泛运用于凝胶电泳和生化分离介质领域。琼脂糖主要来源于海藻，是一种电中性聚合物，其基本结构是由1,3连接的β-d-半乳糖和1,4连接的3,6-内醚-l-半乳糖交替连接组成。琼脂糖在低温下(30-40℃)会形成凝胶，因此利用适当的方法就可以制备具有空间网状结构的凝胶微球。此外琼脂糖分子上数目众多的羟基可以使其容易被改性衍生，连接上不同的基团就可以制备功能不同的层析介质。

3、在离子交换层析介质中，羧甲基琼脂糖凝胶微球是应用最多的弱酸性阳离子交换树脂。传统上制备羧甲基琼脂糖微球的过程中，一般是先制备琼脂糖微球，然后再用羧甲基试剂对琼脂糖微球进行改性；但是该方法难以控制在微球表面和孔道内均匀羧甲基化，并且反应过程中的强碱和高温会对微球的强度和孔道产生影响，影响微球的分离性能。

4、中国专利cn111004337a报道了一种快速制备羧甲基化琼脂糖的方法。该方法利用tempo(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基)和naclo氧化琼脂糖分子上的醇羟基来制备羧甲基化琼脂糖，但是该方法需要多个步骤，工艺步骤比较繁琐；在制备过程需要使用强氧化剂和有机溶剂，反应过程容易产生副反应，也不适宜放大。中国专利cn105363417a报道了一种交联羧甲基琼脂糖微球的合成方法。该方法通过氯乙酸改性琼脂糖制备羧甲基化琼脂糖，然后再以该改性琼脂糖为原料制备羧甲基化琼脂糖微球；微球再用环氧氯丙烷进行交联，制备得到交联羧甲基化琼脂糖微球。在该方法中，琼脂糖的羧甲基修饰反应在乙醇中进行，但是低温下琼脂糖并不能溶于乙醇形成均匀溶液，因此氯乙酸难以充分均匀地取代琼脂糖上的羟基。同时，氯乙酸也会与乙醇反应，这个副反应会降低琼脂糖上羧甲基的取代度；而且，仅用环氧氯丙烷对琼脂糖微球进行一次交联后微球强度不够高，不适用于需要高流速的场景。中国专利cn116099462a报道了一种琼脂糖-纤维素纳米复合多孔凝胶微球的制备方法。该方法利用羧甲基化修饰的纳米纤维素与琼脂糖进行复合，制备含羧甲基的琼脂糖-纤维素纳米复合多孔凝胶微球。然而该方法制备的琼脂糖-纤维素纳米复合微球羧甲基含量较低，若直接用于蛋白分离则效果不理想。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种制备方法简单、适用于高流速场景、且对蛋白的吸附能力高的羧甲基琼脂糖微球的制备方法及其产品。

2、技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供一种羧甲基琼脂糖微球的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)水相的制备：在琼脂糖溶液中加入碱性溶液和羧甲基试剂，反应得到的改性琼脂糖溶液作为水相；

4、(2)油相的制备：将分散剂和有机溶剂混合，得到油相；

5、(3)乳化成球：将步骤(1)得到的水相和步骤(2)得到的油相混合，经过乳化、清洗，得到羧甲基化琼脂糖微球；

6、(4)交联：在步骤(3)得到的羧甲基化琼脂糖微球中加入碱性溶液、nabh4，然后加入交联试剂进行第一阶段的交联反应，再加入交联试剂进行第二阶段的交联反应，经抽滤、洗涤，得到交联琼脂糖微球；

7、(5)羧甲基改性：在步骤(4)得到的交联琼脂糖微球中加入碱性溶液和羧甲基试剂反应，经抽滤、洗涤，得到羧甲基琼脂糖微球。

8、进一步地，步骤(1)中所述琼脂糖溶液的浓度为4％-8％，也即为0.04g/ml～0.08g/ml。

9、进一步地，所述羧甲基试剂为氯乙酸或溴乙酸，所述碱性溶液为naoh或koh溶液。

10、进一步地，步骤(1)中所述羧甲基试剂与琼脂糖质量比为1：1～2。

11、进一步地，步骤(2)中所述分散剂为甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素或油酸山梨坦中的一种或几种；油相包括甲苯、二甲苯、矿物油或环己烷中的一种或几种。

12、进一步地，步骤(3)中所述水相和油相的混合体积比为1：1.2～3。

13、进一步地，步骤(4)中两个阶段的交联试剂为环氧化合物，环氧化合物可以为环氧氯丙烷、1,4-丁二醇双缩水甘油醚、丙三醇三缩水甘油醚或季戊四醇四缩水甘油醚中的一种或几种。

14、进一步地，步骤(4)中第一阶段与第二阶段的交联试剂可以相同，也可以不同，第一阶段的反应温度低于第二阶段的反应温度。

15、低温交联：低温条件下，单糖分子之间通过氢键等弱相互作用结合，形成单层或双层结构的凝胶，这些凝胶之间形成一些空隙。这些空隙可以在下一步高温交联的条件下，生成更多的分子间键，提高凝胶的稳定性和强度。

16、高温交联：高温条件下，凝胶中的单糖分子之间发生较强的交联反应，形成更复杂的网络结构，提高凝胶的机械强度和稳定性。高温交联还可以改变凝胶的孔径大小和分布，从而影响凝胶的吸水性和透性。

17、总之，低温和高温两阶段交联可以提高琼脂糖凝胶的机械强度和稳定性，同时通过控制交联条件还可以调节凝胶的吸水性和透性。

18、进一步地，当完成步骤(4)交联后，琼脂糖凝胶的强度不达标时，可再多次重复步骤(4)进行交联。

19、进一步地，步骤(5)中羧甲基试剂与交联琼脂糖微球的质量比为1：1.5～3。

20、本发明还提供一种由上述方法制备的羧甲基琼脂糖微球。

21、本发明机理：本发明先使琼脂糖在水相中羧甲基化，在琼脂糖成球之前提前接枝羧甲基，可以使得微球形状和羧甲基修饰过程更容易控制，然后乳化成球，再进行交联和二次羧甲基化，制备得到交联的羧甲基琼脂糖微球。通过交联反应，增强微球的稳定性和机械强度。二次羧甲基化可以再次对微球的表面和孔洞就行修饰，改变微球的表面性质和化学特性，提高其对蛋白的吸附能力。

22、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

23、1、本发明制备工艺简便，并且工艺中多步采用水体系，使用有机溶剂较少；

24、2、本发明制备的羧甲基琼脂糖微球上的羧甲基分布更均匀，对牛血清蛋白(bsa)有良好的吸附能力；

25、3、本发明制备的羧甲基琼脂糖微球具有较高的耐压性能，可用于高流速的场景。

技术特征：

1.一种羧甲基琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述琼脂糖溶液的浓度为4％～8％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羧甲基试剂包括氯乙酸或溴乙酸，所述碱性溶液包括naoh或koh溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述羧甲基试剂与琼脂糖质量比为1：1～2。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述分散剂为甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素或油酸山梨坦中的一种或几种；油相包括甲苯、二甲苯、矿物油或环己烷中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述水相和油相的体积比为1：1.2～3。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中两个阶段的交联试剂为环氧氯丙烷、1,4-丁二醇双缩水甘油醚、丙三醇三缩水甘油醚或季戊四醇四缩水甘油醚中的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中第一阶段的反应温度低于第二阶段的反应温度。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中羧甲基试剂与交联琼脂糖微球的质量比为1：1.5～3。

10.一种由权利要求1～9任一项所述方法制备的羧甲基琼脂糖微球。

技术总结
本发明公开了一种羧甲基琼脂糖微球的制备方法及其产品，所述方法包括在琼脂糖溶液中加入碱性溶液和羧甲基试剂，得到的改性琼脂糖溶液作为水相；将分散剂和有机溶剂混合，得到油相；将水相和油相混合，乳化、清洗，得到羧甲基化琼脂糖微球；加入碱性溶液、NaBH<subgt;4</subgt;，分两次加入交联试剂进行交联反应，得到交联琼脂糖微球；加入碱性溶液和羧甲基试剂反应，得到羧甲基琼脂糖微球。本发明制备工艺简便，并且工艺中多步采用水体系，使用有机溶剂较少；制备的羧甲基琼脂糖微球上的羧甲基分布更均匀，对牛血清蛋白(BSA)有良好的吸附能力；具有较高的耐压性能，可用于高流速的场景。

技术研发人员：许德焕,宋芳,黄学英,毛慧明,胡新妹
受保护的技术使用者：苏州赛分科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21