一种用于检测精神活性药物的重组质粒、基因工程菌及应用

本发明涉及环境生物学和环境监测，尤其涉及一种用于检测精神活性药物的重组质粒、基因工程菌及应用。

背景技术：

1、精神活性药物被定义为可以影响人心理功能和情绪状态的一类药物，其被广泛用于治疗心理疾病、镇静或是非法娱乐。根据联合国毒品和犯罪问题办公室2018年的报告，2016年全球约有2.75亿人至少使用过一次精神活性药物，2015年约有167750人直接死于使用精神活性药物。精神活性药物被人们使用后会随排泄物进入污水处理厂，之后随污水厂尾水排放进入环境。通过检测污水中精神活性类药物的赋存倒推精神活性类药物的使用，可以协助精神活性类药物的监管。随着精神活性类药物的生产和使用，其在污水中已被频繁检出，存在浓度波动。因此，对污水中的精神活性药物进行检测，对精神活性类药物监管以及污水流行病学研究具有重要意义。

2、精神活性药物的常规检测手段主要是液相色谱-质谱联用(lc-ms)和高效液相色谱(hplc)技术，虽然这些技术使精神活性药物检测具有高可靠性、高灵敏度和准确性，但它们仍然受到一些限制，例如其要求先进昂贵的设备、专业的技术人员和长时间的分析成本，这些阻碍了它们的现场检测应用。除此之外，利用单荧光蛋白生物传感器已实现在小鼠大脑中原位实时检测精神活性类药物，不失为一种可以考虑的具有应用前景的更优选择。但细胞这种生物工具较为脆弱，需要精细的实验条件和操作，难以做到污水的实时原位检测应用。

3、考虑到精神活性药物的快速检测对其监管以及污水流行病学的研究具有重要意义，开发更简便、快速、稳定的用于污水原位检测精神活性药物的方法是必不可少的。单荧光蛋白生物传感器是一种基于受体构象变化诱导荧光变化的生物传感器，目前已广泛应用于生物医学领域，它的出现为开发环境中精神活性药物的新分析方法提供了前所未有的机会。相较于液质技术，这种单荧光蛋白生物传感器技术成本低，操作简便且快速。相较于细胞，大肠杆菌生长对环境要求不高，能在一定程度上耐受污水。另外，这种单荧光蛋白生物传感器可以做到实时检测的程度，避免了较长的分析时间成本。因此，在污水现场检测精神活性药物的情况下，可优选采用这种单荧光蛋白生物传感器来构建用于快速检测的测定方法。

技术实现思路

1、发明目的：本针对目前精神活性药物检测方法成本昂贵、操作繁琐、时效性低因而无法实现实时原位检测等问题，本发明提供一种用于检测精神活性药物的重组质粒，并基于所述重组质粒构建了基因工程菌用于精神活性药物的检测。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于检测精神活性药物的重组质粒，所述重组质粒通过将目标蛋白基因与载体结合后得到，所述目标蛋白基因序列如seq idno:1所示；所述载体为pet系列表达载体。

3、优选地，所述载体为pet28b(+)载体，所述pet28b(+)载体去掉his标签，信号肽为pelb，所述信号肽的基因序列如seq id no:2所示，信号肽的氨基酸序列如seq id no:3所示。

4、本发明进一步提出了一种用于检测精神活性药物的基因工程菌，通过将上述重组质粒转化大肠杆菌后得到。

5、优选地，所述大肠杆菌为bl21类型的大肠杆菌，优选地，所述大肠杆菌为bl21(de3)大肠杆菌。

6、本发明进一步提出了上述重组质粒或基因工程菌在检测精神活性药物，其中，所述精神活性药物为能与htr2a受体作用的药物。所述精神活性药物为能与htr2a受体作用的药物；所述精神活性药物包括但不限于氟西汀、酮色林、氟利色林，激动剂有doi、5-ht、lsd、美斯卡林和赛洛西宾。

7、本发明进一步提出了一种基于受体构象诱导荧光变化的定量快速检测精神活性药物方法，包括如下步骤：

8、(1)将权利要求3或4所述的基因工程菌活化；

9、(2)将活化后的基因工程菌用iptg孵育诱导荧光表达；

10、(3)将待测的精神活性药物加入到诱导了荧光的菌液中，用酶标仪读取荧光，同时检测od600值，计算后与定量曲线进行比对得到待测精神活性药物的浓度。

11、其中，步骤(1)中活化的方法为：先将基因工程菌扩大培养，然后将扩大培养的菌液按照1：10～1：30稀释，于20℃～40℃、200-300r/min条件下震荡培养3h，使菌株培养至对数期；其中，扩大培养的方法为：将冻存于-80℃甘油中的基因工程菌株取出置于冰上，先接种于含卡那霉素的固体培养基上过夜培养优选地，37℃恒温培养箱中培养，第二天挑取单菌落于液体培养基中过夜，培养条件为37℃、200-300r/min条件下震荡培养18h。

12、优选地，诱导荧光表达的条件为0.01mm～5mm iptg，于20℃～40℃℃、200-300r/min恒温震荡0～4h，优选地，诱导荧光表达的条件为0.75mm iptg，于25℃、200-300r/min恒温震荡2h。

13、优选地，步骤(3)中，荧光检测条件为：激发光：激发光：400-500nm，发射光：500-600nm。

14、步骤(3)中，归一化荧光计算方法为：f/f0＝(总荧光强度i/od600i)/(总荧光强度ck/od600ck)，总荧光强度i代表检测样本的总荧光强度，od600i代表检测样本的od600值，总荧光强度ck代表空白对照的总荧光强度，od600ck代表空白对照的od600值。

15、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

16、(1)本发明的方法无需昂贵的仪器和专业的检测人员，也不需要繁琐的前处理和长时间的培养孵育或分析，即可对水中精神活性药物进行快速识别与定量检测；

17、(2)本发明的方法将融合蛋白在大肠杆菌中表达，可以有效提高生物传感器在不同环境下的稳定性；

18、(3)本发明利用受体蛋白与目标污染物的特异性结合，实现精神活性药物的针对性检测；

19、(4)本发明利用受体蛋白与目标污染物的快速结合以及实时的受体构象改变诱导的荧光变化，显著的提高了生物传感器的反应时间，从而实现实时快速检测。

技术特征：

1.一种用于检测精神活性药物的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒通过将目标蛋白基因与载体结合后得到，所述目标蛋白基因如seq id no:1所示；所述载体为pet系列表达载体。

2.根据根据权利要求1所述的用于检测精神活性药物的重组质粒，其特征在于，所述载体为pet28b(+)载体，所述pet28b(+)载体去掉his标签，信号肽为pelb，所述信号肽的基因序列如seq id no:2所示，信号肽的氨基酸序列如seq id no:3所示。

3.一种用于检测精神活性药物的基因工程菌，其特征在于，通过将权利要求1或2所述的重组质粒转化大肠杆菌后得到。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为bl21类型的大肠杆菌，优选地，所述大肠杆菌为bl21(de3)大肠杆菌。

5.权利要求1所述的重组质粒或权利要求3所述的基因工程菌在检测精神活性药物，其中，所述精神活性药物为能与htr2a受体作用的药物；所述精神活性药物包括氟西汀、酮色林、氟利色林，激动剂有doi、5-ht、lsd、美斯卡林和赛洛西宾。

6.一种基于受体构象诱导荧光变化的定量快速检测精神活性药物方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中活化的方法为：先将基因工程菌扩大培养，然后将扩大培养的菌液按照1：10 ~ 1：30稀释，于20℃~40℃、200-300r/min条件下震荡培养3h，使菌株培养至对数期；其中，扩大培养的方法为：将冻存于-80℃甘油中的基因工程菌株取出置于冰上，先接种于含卡那霉素的固体培养基上过夜培养优选地，37℃恒温培养箱中培养，第二天挑取单菌落于液体培养基中过夜，培养条件为37℃、200-300r/min条件下震荡培养18h。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，诱导荧光表达的条件为0.01mm~5mm iptg，于20℃~40℃℃、200-300r/min恒温震荡0~4h，优选地，诱导荧光表达的条件为0.75mmiptg，于25℃、200-300r/min恒温震荡2h。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，荧光检测条件为：激发光：激发光：400-500nm，发射光：500-600nm。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，归一化荧光计算方法为：f/f0=（总荧光强度i/od600i）/（总荧光强度ck/od600ck），总荧光强度i代表检测样本的总荧光强度，od600i代表检测样本的od600值，总荧光强度ck代表空白对照的总荧光强度，od600ck代表空白对照的od600值。

技术总结
本发明公开了一种用于检测精神活性药物的重组质粒，并基于其构建了用于检测精神活性药物的基因工程菌。本发明通过将绿色荧光蛋白cpGFP插入人类5‑HT受体HTR2A的第三个环中（GenBank:MW285156.1）构建融合蛋白，利用受体与精神活性药物结合后的构象变化诱导荧光强度变化，从而实现快速定量检测精神活性药物的目的。本发明针对精神活性药物建立了快速定量检测方法，可实现原位实时监测，且操作简便，成本低廉，灵敏度高，结果可靠，是具有竞争力的精神活性药物快速检测方法，对精神活性类药物监管以及污水流行病学研究具有重要意义。

技术研发人员：吴兵,何若男,任洪强
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/21