一种利用基因编辑提高花生花青素含量的方法

本发明属于基因工程，尤其涉及一种利用基因编辑提高花生花青素含量的方法。

背景技术：

1、花生是全世界最重要的油料和经济作物之一，是人类蛋白质、植物油脂和其他营养物质的重要来源。我国是世界上花生年产量最高的国家，在我国油料作物中花生种植面积仅次于油菜和大豆，但产量居于首位，因此花生生产对保障我国粮油安全具有重大战略意义。花生种皮颜色是花生重要的品质性状。与传统的粉色花生相比，深色花生如黑色花生种皮中含有更多的花青素，具有抑制超氧化自由基、抗氧化等多种功效。虽然黑种皮花生的单价往往数倍于普通花生，但消费需求旺盛，市场潜力巨大。而现有的黑种皮花生品种一般产量较低，且抗性较差，难以大面积推广，因此创制品质优良、产量较大的黑种皮花生品种是满足市场需求的根本途径。

2、花生种皮中花青素的种类、含量和分布决定了种皮颜色性状的差异(李海芬,邱金梅,陈小平等.花生花青素合成相关基因的表达与种皮颜色关系[j].中国油料作物学报,2017,39(5):6.)。花青素是植物中广泛存在的一类水溶性的天然色素，属于类黄酮化合物。花青素生物合成代谢途径在植物中十分保守，起始于苯丙氨酸代谢。其主要过程如下：①苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶(phenylalanine ammonialyase，pal)的作用下转化成肉桂酸；②肉桂酸在肉桂酸4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase，c4h)的作用下转化为香豆酸；③香豆酸在4-香豆酰coa连接酶(4-coumaryl coaligase，4cl)的作用下与辅酶a结合，生成4-香豆酰coa；④4-香豆酰coa与三个丙二酰coa在查尔酮合成酶(chalcone synthase，chs)的作用下生成查尔酮；⑤查尔酮由查尔酮异构酶(chalcone isomerase，chi)转化生成柚皮素；⑥柚皮素由黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase，f3h)的作用下生成二氢黄酮醇(二氢山奈酚)；⑦二氢黄酮醇由类黄酮-3’-羟化酶(flavonoid 3’-hydroxylase，f3’h)的催化作用下生成二氢槲皮素，或在类黄酮-3’,5’-羟化酶(flavonoid 3’,5’-hydroxylase，f3’5’h)的作用下生成二氢杨梅素；⑧二氢黄酮醇、二氢杨梅素和二氢槲皮素经二羟基黄酮醇还原酶(dihydroflavonol4-reductase，dfr)分别生成无色天竺葵素、无色飞燕草素和无色矢车菊素等三种无色花青素苷元；⑨无色花青素苷元由花青素合成酶(anthocyaninsynthase，ans)催化生成花青素苷元；⑩花青素苷元由尿苷二磷酸葡萄糖：类黄酮-3-o-糖基转移酶(udp-glc:flavonoid-3-o-glucosyltransferase，ufgt)等糖基转移酶类催化添加糖基，以及受甲基转移酶(methyl transferase，mt)、酰基转移酶(acyl transferase，at)等酶的催化修饰，最终形成性质稳定、色彩各异的花青素(winkel-shirley b.flavonoidbiosynthesis.acolorful model for genetics,biochemistry,cell biology,andbiotechnology[j].plant physiology,2001,126(2):485-93.)。

3、和其他很多植物一样，花生的种皮是也是由珠被发育而来的，种皮颜色由母体的基因型决定。和其他性状相比，种皮颜色要在隔代才能显现，例如，粉红种皮做母本与黑花生父本进行杂交，f1种皮是粉红色的，f2种皮是淡黑(双亲中间型)的，f3种皮才出现性状分离。这一特性使得传统育种手段培育黑种皮花生品种受到了很大的限制。因此，提供一种利用基因编辑技术创制高花青素含量花生材料的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。但目前尚未见到利用crispr-cas9技术提高花生花青素含量并创新种质的报道。

4、针对以上不足，本发明公开了一对靶向花生cd1pg8基因的sgrna，通过基因编辑技术创制cd1pg8基因突变的花生基因编辑材料花青素含量显著提高，进而培育高花青素含量的基因编辑植物品种，对于培育高附加值的高花青素含量花生新品种具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出了一种利用基因编辑提高花生花青素含量的方法，通过基因编辑技术创制cd1pg8基因突变的花生基因编辑材料花青素含量显著提高，进而培育高花青素含量的基因编辑植物品种，对于培育高附加值的高花青素含量花生新品种具有重要意义。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种利用基因编辑提高花生花青素含量的方法，包括利用crisper-cas9基因编辑系统对花生材料中的cd1pg8基因进行编辑，获得高花青素含量花生材料的步骤。

3、优选的，具体步骤如下：

4、(1)sgrna靶点设计：根据如seq id no.5所示的cd1pg8基因序列设计两个sgrna靶点，sgrna1的靶点序列如seq id no.3所示，sgrna2的靶点序列如seq id no.4所示；

5、(2)构建crisper/cas9重组质粒：seq id no.3所示序列加接头attg，seq id no.4所示序列加接头aaac，退火形成双链靶点，与atu6-26-sgrna-sk质粒连接转化，经nhe i和spe i双酶切后，，获得sgrna1靶点的表达盒和sgrna2靶点的表达盒；将所述sgrna1靶点的表达盒和所述sgrna2靶点的表达盒与crisper/cas9载体链接，得crisper/cas9重组质粒；

6、(3)将所述crisper/cas9重组质粒转入农杆菌，侵染花生材料，经筛选验证获得缺失cd1pg8基因功能且无外源基因插入的花生材料，得高花青素含量的花生材料。

7、优选的，在步骤(2)中，所述双链靶点的退火反应体系为：10μm正向引物、反向引物各10μl，加入80μl 0.5×te缓冲液；所述正向引物为seq id no.3所示序列加接头attg；所述反向引物为seq id no.4所示序列加接头aaac。

8、优选的，在步骤(2)中，所述双链靶点的退火反应程序为：98℃加热3min后自然冷却至室温。

9、优选的，在步骤(2)中，用t4 dna连接酶连接所述sgrna1靶点和sgrna2靶点的表达盒与crispr/cas9载体，获得crispr/cas9重组质粒。

10、优选的，所述t4 dna连接酶连接的体系为：10×t4 dna连接酶缓冲液1μl、酶切后的pcambia1300-pyao:cas9质粒40ng、sgrnacassette 10ng、t4 dna连接酶0.2μl、加水补足至10μl，反应程序为：室温连接25min。

11、本发明还提供了一对靶向花生cd1pg8基因的sgrna，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2，所述sgrna1核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna2核苷酸序列如seq idno.2所示。

12、优选的，所述sgrna1识别cd1pg8基因的第16～35位，所述sgrna2识别cd1pg8基因的第82～101位，所述sgrna1的靶点序列如seq id no.3所示，所述sgrna2的靶点序列如seqid no.4所示，所述cd1pg8基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。

13、本发明还提供了所述的sgrna在花生育种中的应用。

14、本发明还提供了所述的sgrna在获得高花青素含量的花生材料中的应用。

15、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

16、本发明研究发现通过基因编辑技术创制cd1pg8基因突变的花生基因编辑材料花青素含量显著提高，进而培育高花青素含量的基因编辑植物品种。实验表明，通过crispr-cas9技术根据本发明所述的cd1pg8的特异靶标dna序列设计的一对sgrna介导cas9核酸酶对靶标位点进行特异性识别和靶向切割，并利用胞内易错修复机制引入突变，导致基因编辑花生中cd1pg8基因突变，能够提高基因编辑花生的花青素含量。表明通过基因编辑技术，利用cd1pg8基因可以对水稻的花青素含量进行快速、定向的遗传改良。该发明利用现代基因工程方法，人为控制花青素积累水平，对加速培育优质高产的高花青素含量花生新品种，提高花生产业经济效益具有重要意义。