一种生物酶共价催化合成O-羧甲基壳聚糖的方法及其应用与流程

：本发明涉及化妆品领域，尤其涉及一种生物酶共价催化合成o-羧甲基壳聚糖的方法及其应用。

背景技术

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背景技术：

1、壳聚糖为天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，具有无毒性、成膜性、吸附性等多种良好的性质，可广泛应用于食品保鲜、化妆品添加、生物医学等众多领域，但由于壳聚糖的分子结构中存在大量高度延伸的氢键半结晶结构，使其在水中的溶解性很差，只溶于酸中，应用于产品时呈酸性，对皮肤有刺激性，限制了壳聚糖在化妆品中的应用。

2、羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，为一种两性聚电解质，其是在脱乙酰壳聚糖高分子链上引入亲水基团-ch2coo-而成，脱乙酰壳聚糖经羧甲基化改性后，提高了水溶性，增加了对细胞的吸附性以及其生物活性。羧甲基壳聚糖已被用于化妆品的开发，如吸湿或保水剂、乳液稳定材料、抗氧化剂或抗菌剂等。壳聚糖上的6-oh和2-nh2都可以参与反应，形成多种羧甲基化衍生物，相比于n-羧甲基壳聚糖和n，o-羧甲基壳聚糖，o-羧甲基壳聚糖具有良好的水溶性能和最优的保湿、抑菌性能。

3、目前工业制备o-羧甲基壳聚糖的方式是：在较低温度环境下，壳聚糖在有机溶剂和碱性介质中与氯乙酸进行反应，将羧甲基引入壳聚糖的o-位。但该方法存在诸多缺点：1)消耗大量氢氧化钾、氢氧化钠等强碱和有机溶剂，生产成本高，环境污染严重，碱耗、能耗、废水量大；2)反应条件较为苛刻，3)副反应多：存在两种副反应，氯乙酸水解生成羟基乙酸，以及羧甲基引入壳聚糖的n-位形成n-羧甲基壳聚糖产物；4)制得的羧甲基壳聚糖取代度低，水溶性差，产品抑菌活性和保湿性能降低。

4、因此，针对上述问题，亟需开发一种清洁环保、高效、低成本、易于实施的o-羧甲基壳聚糖制备工艺，以实现壳聚糖的高效转化利用。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明提供了一种生物酶共价催化合成o-羧甲基壳聚糖的方法及其应用，在常规工业羧甲基壳聚糖制备方法的基础上，引入了固定化生物酶，降低壳聚糖合成o-羧甲基壳聚糖反应的活化能，解决了现有技术制备o-羧甲基壳聚糖过程中碱、酸及有机溶剂使用量大、副反应发生较多导致制得的羧甲基壳聚糖取代度低，水溶性差的问题。

2、本发明是通过以下技术方案予以实现的：

3、一种生物酶共价催化合成o-羧甲基壳聚糖的方法，该方法包括以下步骤：

4、s1：向30℃以下的35-45wt％的naoh溶液中加入壳聚糖，室温放置24-72小时；加入异丙醇，浸泡4-6h，搅拌30-60分钟，得到混合液a；

5、s2：将氯乙酸溶于异丙醇中，加入固定化生物酶，得到混合液b；

6、s3：将混合液b逐滴加入混合液a中，控制温度不超过60℃，滴完后保温搅拌3-4h，得到混合液c；

7、s4：在混合液c中加入3wt％～8wt％的盐酸溶液，调节ph至7-8，与乙醇混合进行醇沉反应得到沉淀产物，过滤，滤饼用乙醇冲洗2-3遍后干燥至恒重，得到o-羧甲基壳聚糖。

8、优选地，步骤s1中，壳聚糖、naoh溶液与异丙醇的重量比为1：(1.5-2.5)：(4-6)。

9、优选地，步骤s2中，所述固定化生物酶是含有羧基端的酶例如atp酶、羧肽酶等，用多糖或糊精包裹。

10、其制备包括以下步骤，将多糖或糊精水溶液与含有羧基端的酶混合，在室温超声30min，静置1小时以上，得到固定化生物酶。

11、优选的，步骤s2中，所述固定化生物酶为固定化atp酶或固定化羧肽酶。

12、优选地，步骤s2中，氯乙酸、固定化生物酶与异丙醇的重量比为(10-20)：(0.1-0.3)：(50-65)。

13、优选地，步骤s3中，混合液b与混合液a的重量比为(0.1-0.3)：1。

14、优选地，步骤s4中，混合液c与乙醇的重量比为1：(1.0-1.5)。

15、工业上制备o-羧甲基壳聚糖的原理是，在有机溶剂异丙醇介质中以及氢氧化钠催化作用下，氯乙酸与壳聚糖的羟基发生醚化反应，生成羧甲基壳聚糖。本发明在此基础上，引入了固定化生物酶。

16、固定化生物酶可保护酶不受酸性的影响，使其得以在氯乙酸中存在，在较长时间内保持较高的活性。同时，酶中的-cooh基团与氯乙酸发生亲核取代(sn2)反应，生成不稳定共价过渡态中间体。

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18、混合液a中壳聚糖不溶于异丙醇，壳聚糖和有机溶剂中的氢氧化钠碰撞几率小，加入混合液b后，混合液b中的过渡态中间体与混合液a中的碱化的壳聚糖发生反应，倾向于将羧甲基引入壳聚糖的o-位，形成o-羧甲基壳聚糖。

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20、本发明还保护上述方法得到的o-羧甲基壳聚糖在制备护肤品的应用，所述护肤品为面膜、润肤膏霜、洁面乳、化妆水、润肤乳液中的一种。

21、本发明的有益效果如下：

22、1)与现有技术相比，本发明固定化生物酶能降低壳聚糖与氯乙酸反应的活化能，倾向于将羧甲基引入壳聚糖的o-位，形成o-羧甲基壳聚糖，提高o-羧甲基壳聚糖的收率，得到的产品水溶性好，产品抑菌活性和保湿性能提高，且显著减少naoh、异丙醇、氯乙酸的用量，减少了能量消耗，更加经济环保。

23、2)本发明方法制得的o-羧甲基壳聚糖，水溶性好高，保湿性能佳，具有优异的促进伤口愈合的能力，可在化妆品中广泛应用。

技术特征：

1.一种生物酶共价催化合成o-羧甲基壳聚糖的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，壳聚糖、naoh溶液与异丙醇的重量比为1：(1.5-2.5)：(4-6)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述固定化生物酶是含有羧基端的酶用多糖或糊精包裹。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述固定化生物酶为固定化atp酶或固定化羧肽酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，氯乙酸、固定化生物酶与异丙醇的重量比为(10-20)：(0.1-0.3)：(50-65)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3中，混合液b与混合液a的重量比为(0.1-0.3)：1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s4中，混合液c与乙醇的重量比为1：(1.0-1.5)。

8.如权利要求1-7中任意一项权利要求所述的方法得到的o-羧甲基壳聚糖在制备护肤品的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述护肤品为面膜、润肤膏霜、洁面乳、化妆水、润肤乳液中的一种。

技术总结
本发明公开了一种生物酶共价催化合成O‑羧甲基壳聚糖的方法，向溶于异丙醇的氯乙酸中加入含有羧基的固定化生物酶，容易与氢氧化钠催化条件下异丙醇介质中的壳聚糖反应，且更倾向于与壳聚糖上被活化的羟基反应，生成O‑羧甲基壳聚糖。本发明的方法减少了碱性试剂以及有机溶剂的用量，更加经济环保，提高了反应的专一性，提高了目标产物的产量和纯度，减少了副反应和后处理步骤。本发明方法制得的O‑羧甲基壳聚糖，水溶性好高，保湿性能佳，具有优异的促进伤口愈合的能力，可在化妆品中广泛应用。

技术研发人员：林助凤,刘紫圆
受保护的技术使用者：爱西美（珠海）生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27