用于样本的核酸释放扩增组合物、扩增方法、试剂盒及其应用与流程

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及用于样本的核酸释放扩增组合物、扩增方法、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、当前市面上大部分常见的核酸检测试剂形式为液体形态，使用时需要将液体组分1和组分2化冻后，按一定比例混合均匀，再加入经提纯后的样本核酸后进行扩增，此种操作流程需要在专业的pcr实验室进行配液、提取、加样、扩增，过程繁琐、需要经培训的专业人员操作。

2、随着冻干技术在核酸试剂上的广泛应用，目前已有产品采用全组分预混冻干粉或冻干球扩增试剂形式，使用时需先加入复溶液复溶冻干试剂，再加入提纯的核酸，亦或是直接取提纯的核酸复溶冻干试剂，再进行扩增反应。虽然这种冻干试剂形式减少了配液的过程，但样本的提纯操作仍需要大量的手工步骤和专业人员来完成，而且加入复溶液复溶冻干试剂的步骤也会增加人员操作，因复溶后试剂占一定体积，加入核酸样本的量也受到限制。

3、以上技术方案的操作流程有两种，一是样本采集入保存液，取部分样本液加入释放剂裂解，再加入液体扩增试剂中进行扩增；二是样本采集入高浓度裂解剂的释放剂中裂解，高浓度裂解剂加入过多会直接影响下游pcr扩增，因此操作时需先配制液体试剂，仅能取少量样本液加入液体试剂中进行扩增，扩增灵敏度不高。第一种操作流程需要配液、多次转管操作，加入样本液的体积也有一定限制，手工操作步骤较多，灵敏度难以提升。第二种操作流程需要手工配液、加入样本液的体积有一定限制，灵敏度难以提升。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了用于样本的核酸释放扩增组合物、扩增方法、试剂盒及其应用。本发明通过改变释放剂配方组分，降低对下游扩增的抑制，同时采用全组分预混干燥试剂形态，调整干燥试剂组分含量，使原本复杂的操作流程简化为拭子样本加入释放剂中裂解，取部分样本裂解液直接加入干燥试剂中，上机扩增。干燥试剂可实现常温储运使用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了用于样本的核酸释放扩增组合物，包括：扩增干试剂和释放剂；

4、所述释放剂包括：裂解剂、rna酶抑制剂和0.2～16.04mm蛋白抑制剂；

5、所述裂解剂包括：10～50mm的强碱、0.1～6％(v/v)的非离子表面活性剂、0.002～0.6％(m/v)的离子表面活性剂；

6、所述扩增干试剂包括：扩增试剂和冻干保护剂。

7、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述扩增试剂包括：4.8～120mm的tricine、3.8～120mm的kcl和0.54～15mm的mgcl2。

8、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述干燥保护剂包括棉子糖、松三糖、β-环糊精、甘露醇、bsa和peg20000。

9、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述干燥保护剂包括：2～9％(w/v)的棉子糖、0.5～4％(w/v)的β-环糊精、0.5～9％(w/v)的甘露醇、0.3～3.5％(w/v)的bsa和0.5～6％(w/v)的peg20000。

10、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述干燥保护剂包括：2.5～8％(w/v)的棉子糖、1～3.5％(w/v)的β-环糊精、1～8％(w/v)的甘露醇、0.5～3％(w/v)的bsa和1～5％(w/v)的peg20000。

11、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述干燥保护剂包括：2％(w/v)、5％(w/v)或9％(w/v)的棉子糖。

12、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述干燥保护剂包括：0.5％(w/v)、3％(w/v)或4％(w/v)的β-环糊精。

13、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述干燥保护剂包括：0.5％(w/v)、6％(w/v)或9％(w/v)的甘露醇。

14、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述干燥保护剂包括：0.3％(w/v)、1％(w/v)或3.5％(w/v)的bsa。

15、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述干燥保护剂包括：0.5％(w/v)、3.5％(w/v)或6％(w/v)的peg20000。

16、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述干燥保护剂包括：5％(w/v)的棉子糖、3％(w/v)的β-环糊精、6％(w/v)的甘露醇、1％(w/v)的bsa和3.5％(w/v)的peg20000。

17、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述扩增干试剂还包括：缓冲液、酶、引物和/或探针中的一种或多种。

18、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述释放剂稀释扩增干试剂中的酶、引物、探针的终浓度至：

19、每扩增反应包括0.2～0.6μm的靶序列引物探针组，3～20u的taq dna聚合酶、200u的逆转录酶和/或rtth酶和/或bst酶。

20、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中所述强碱包括koh和/或naoh；

21、所述非离子表面活性剂包括聚氧乙烯月桂醚和/或tritonx-100；

22、所述离子表面活性剂包括十二烷基硫酸钠；

23、rna酶抑制剂包括2～100μg/ml的聚乙烯磺酸钠和/或0.5～3mm的金属离子螯合剂。

24、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中所述聚氧乙烯月桂醚的别名为4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇,t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇,聚乙二醇叔辛基苯醚，线性分子式:t-oct-c6h4-(och2ch2)xoh,x＝9-10)。

25、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述蛋白抑制剂包括厄多司坦和/或tcep。

26、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述tcep的别名为三(2-羧乙基)膦)。

27、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述裂解剂包括：40mm的naoh、3％(v/v)的聚氧乙烯月桂醚和0.02％(m/v)的sds；或

28、40mm的naoh、3％(v/v)的聚氧乙烯月桂醚、0.02％(m/v)的sds和4％(v/v)的tritonx100。

29、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述rna酶抑制剂包括：55μg/ml的聚乙烯磺酸钠。

30、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述蛋白抑制剂包括：4mg/ml的厄多司坦和/或0.2mm的tcep。

31、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述裂解剂还包括：扩增剂、防腐剂和/或消泡剂中的一种或多种。

32、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述扩增剂包括：4％(w/v)的海藻糖和1.5mg/ml的bsa。

33、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述防腐剂包括：0.05％(v/v)的nan3。

34、在本发明的一些实施方案中，上述核酸释放扩增组合物中，所述消泡剂包括：0.3％(v/v)的se-15。

35、本发明还提供了上述核酸释放扩增组合物在制备核酸检测和/或扩增的试剂盒中的应用。

36、本发明还提供了核酸扩增的方法，以核酸释放扩增组合物与待测样本混合后，取部分混合液作为核酸模板加入扩增干试剂中进行核酸扩增；

37、所述混合不包括与保存液混合的步骤；

38、所述核酸扩增包括pcr或等温扩增。

39、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述核酸为病毒的核酸。

40、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述病毒为新型冠状病毒。

41、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述待测样本与所述扩增试剂的体积比为(1～5):(2～1)。

42、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述待测样本与原液体试剂的体积比值应为1:2～5:1。

43、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述原液体试剂指冻干球扩增试剂在冻干前呈液体状态的试剂。

44、在本发明的一些实施方案中，核酸扩增的方法中，所述混合液稀释扩增干试剂中的酶、引物、探针的终浓度至：

45、每扩增反应包括0.2～0.6μm的靶序列引物探针组，3～20u的taq dna聚合酶、200u的逆转录酶和/或rtth酶和/或bst酶。

46、本发明还提供了核酸检测试剂盒，包括上述核酸释放扩增组合物以及可接受的助剂或载体。

47、在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒中，还包括：dntp混合物、mg2+、甜菜碱、kcl、酶组合物和/或扩增缓冲液中的一种或多种。

48、在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒中，还包括：0.15mm dntp混合物、2.5mmmg2+、50mm kcl和/或3m甜菜碱中的一种或多种。

49、在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒中，所述酶组合物包括：5u taq dna聚合酶、200u逆转录酶、0.5u或40u ung酶，或10u rtth酶，或8ubst酶。

50、在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒中，所述扩增缓冲液包括：2.5％tween20/tween80。

51、在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒中，所述mg2+以氯化镁或硫酸镁的形式添加。

52、本发明还提供了冻干球的制备方法，包括：取所述扩增试剂配制成预混液，使用自动化分液设备将预混液滴入冻干容器内，滴液体积可为15μl～50μl，再将含有预混液的冻干容器放入冻干机内冻干。

53、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述冻干程序包括：预冻保温阶段：-40℃2小时，抽真空；一次干燥阶段：-30℃9小时；二次干燥阶段：15℃2小时，35℃4小时。

54、本发明还提供了风干形式的扩增试剂的制备方法：取所述扩增试剂配制成预混液，使用自动化分液设备将预混液滴入容器表面，滴液体积可为5nl～30μl，再将滴有风干试剂的风干容器敞口放置于相对湿度低于rh30％的车间风干30min，或放置于鼓风干燥箱中45℃烘干5小时。

55、在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒中，所述引物包括：引物1～引物4中的一种或多种；

56、所述引物1具有如seq id no:1所示的序列：ccctgtgggttttaca cttaa。

57、所述引物2具有如seq id no:2所示的序列：acgattgtgcatcag ctga。

58、所述引物3具有如seq id no:3所示的序列：ccgtctgcggtatgt ggaaaggttatg。

59、所述引物4具有如seq id no:4所示的序列：ggggaacttctc ctgctagaat。

60、在本发明的一些实施方案中，上述探针包括：探针1和/或探针2；

61、所述探针1具有如seq id no:5所示的序列：cagacattttgctct caagctg。

62、所述探针2具有如seq id no:6所示的序列：ttgctgctgcttgac agatt。

63、本发明提供了试剂盒，包括：

64、

65、本发明提供了用于样本的核酸释放扩增组合物，包括：扩增干试剂和释放剂；

66、所述释放剂包括：裂解剂、rna酶抑制剂和0.2～16.04mm蛋白抑制剂；

67、所述裂解剂包括：10～50mm的强碱、0.1～6％(v/v)的非离子表面活性剂、0.002～0.6％(m/v)的离子表面活性剂；

68、所述扩增干试剂包括：扩增试剂和冻干保护剂。

69、本发明通过改变释放剂配方组分，降低对下游扩增的抑制，同时采用全组分预混干燥试剂形态，调整干燥试剂组分含量，使原本复杂的操作流程简化为拭子样本加入释放剂中裂解，取部分样本裂解液直接加入干燥试剂中，上机扩增。干燥试剂可实现常温储运使用。