提高小麦对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法及抗除草剂小麦

本发明属于基因工程，涉及一种提高小麦对hppd抑制剂类除草剂抗性的方法及抗除草剂小麦。

背景技术：

1、在农业生产中，杂草与作物争夺水分，养分与光照，对作物的生长以及产量产生了严重的影响。小麦作为世界上重要的粮食作物之一，面临着严峻的杂草压力。化学除草剂因其能够快速高效的杀死杂草而被广泛应用。但是对于大多数除草剂，只能在部分作物中使用，如硝磺草酮等hppd抑制剂类除草剂，主要在玉米等作物中应用较多，但是在杀死禾本科杂草的同时，也会对小麦造成伤害，限制了其在小麦中的应用范围。

2、hppd抑制剂类除草剂自20世纪90年代起开始在世界范围内得到应用，是现代除草剂的主要类别之一，能够用于防治一些禾本科和苋科杂草。因其具有广谱、高效和安全的特性，在全球农业生产中得到了广泛应用。该类除草剂的作用机理是抑制植物体内一种名为4-羟基苯基丙酮二氧化酶（hppd）的酶，这种酶在植物的色素合成过程中起着关键作用。hppd的活性被抑制后，会导致叶绿素和胡萝卜素的合成受阻，使植物不能正常进行光合作用，最终导致杂草产生白化的表型并死亡。

3、目前，已经发现有些品种的水稻具有自然的hppd抑制剂抗性，苯并环酮(benzobicyclon, bbc)是一种能够抑制hppd的β-三酮类除草剂。研究人员目前鉴定出一种称为oshis1（hppd inhibitor sensitive 1）的水稻基因赋予了水稻对bbc和其他β-三酮类除草剂的抗性，水稻品种的遗传变异能为进一步的品种育种改良提供资源。oshis1基因的发现为我们提供了一种可能的策略，即利用该基因在小麦中获得相应的除草剂抗性。

4、为了减少小麦中杂草对小麦生长的危害，保证小麦的粮食产量，通过转基因技术培育能够对hppd抑制剂类除草剂产生抗性的小麦是一种高效实用的育种方法，具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种提高小麦对hppd抑制剂类除草剂抗性的方法及抗除草剂小麦，利用基因枪转化方法在小麦中异源表达水稻oshis1基因，获得抗hppd抑制剂类除草剂小麦新种质。

2、本发明的解决上述技术问题的技术方案如下。

3、一种提高小麦对hppd抑制剂类除草剂抗性的方法，通过在小麦中过表达水稻oshis1基因，使小麦对hppd抑制剂类除草剂产生抗性。

4、进一步地，该方法，包括如下步骤：

5、s1.构建过表达载体pubi-oshis1；

6、s2.通过基因枪轰击小麦未成熟胚介导的转基因方式进行pubi-oshis1的转入；

7、s3.通过 pcr检测确定转基因阳性株系；

8、s4.通过hppd抑制剂类除草剂对转基因幼苗的喷施，筛选具有除草剂抗性的阳性苗。

9、进一步地，该方法的步骤s1包括如下过程：

10、（1）对中间载体pubi-hgfp进行酶切处理；

11、（2）提取水稻叶片中总rna，将总rna逆转录合成cdna第一链，设计带有同源臂的引物his-f0和his-r0，以水稻cdna为模板进行pcr 扩增，获得的pcr产物再进行电泳和胶回收；

12、（3）将目的基因构建到与玉米泛素启动子启动的经过酶切处理的中间载体pubi-hgfp上，再将获得的中间载体片段与步骤（2）中回收的pcr产物进行同源重组，获得目标转基因载体pubi-oshis1，即，过表达载体pubi-oshis1。

13、更进一步地， his1-f0和his1-r0的序列分别为：

14、his1-f0:ctgcaaagcttgtcgacggatccatggctgacgagtcatggagggc；

15、his1-r0:gtgatttcagcgtaccgaattcccgggtcagatcctcagggagtcgatgtacctc；

16、其中，his1-f0中的ctgcaaagcttgtcgacggatcc和his1-r0中的gtgatttcagcgtaccgaattcccggg为同源臂接头。

17、进一步地，该方法中，步骤s2的过程为，将步骤s1中构建好的过表达载体pubi-oshis1与促进小麦的再生效率的载体在小麦中进行混合共同遗传转化，再经过组织培养后获得t0代植株。

18、进一步地，该方法中，步骤s3的过程为，对步骤s2中获得的t0代植株分别使用f1/r1，f2/r2，以及通用引物als-f/r进行pcr检测，确认是否有转基因插入。

19、更进一步地，f1/r1，f2/r2，以及通用引物als-f/r的序列分别为：

20、f1: gatggcatatgcagcagctatatgtg；

21、r1: tgatcagcaatgtgtgaggagttgc；

22、f2: atggctgacgagtcatggagggc；

23、r2: gaggtacatcgactccctgaggatctga；

24、als-f: gcgatgtaccctggcaaactcat；

25、als-r: gcgccgacatcctcgtcgag。

26、进一步地，该方法，还包括如下步骤：

27、s5. 通过温室和田间试验，进一步验证转基因小麦对hppd抑制剂的抗性。

28、一种抗除草剂小麦，该抗除草剂小麦中含有过表达的水稻oshis1基因。

29、本发明提高小麦对hppd抑制剂类除草剂抗性的方法及抗除草剂小麦，其有益效果为，通过该方法，为小麦田的杂草管理提供了一个新的有效的工具；该方法不仅可以提高小麦田的杂草管理效率，降低除草成本，有利于环境保护和农业可持续发展，同时还具有不影响小麦的正常生长和产量的农艺性状；总而言之，本发明提供了一种通过在小麦中异源表达表达水稻基因oshis1进而提高小麦对hppd抑制剂类除草剂抗性的有效方法，同时提供了一种具有hppd类抑制剂抗性的小麦品种。

技术特征：

1.一种提高小麦对hppd抑制剂类除草剂抗性的方法，其特征在于，通过在小麦中过表达水稻oshis1基因，使小麦对hppd抑制剂类除草剂产生抗性。

2.如权利要求1所述的提高小麦对hppd抑制剂类除草剂抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤s1包括如下过程：

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述过程（2）中， his1-f0和his1-r0的序列分别为：

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤s2的过程为，将步骤s1中构建好的过表达载体pubi-oshis1与促进小麦的再生效率的载体在小麦中进行混合共同遗传转化，再经过组织培养后获得t0代植株。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤s3的过程为，对步骤s2中获得的t0代植株分别使用f1/r1，f2/r2，以及通用引物als-f/r进行pcr检测，确认是否有转基因插入。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于， f1/r1，f2/r2，以及通用引物als-f/r的序列分别为：

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：

9.一种抗除草剂小麦，其特征在于，该抗除草剂小麦中含有过表达的水稻oshis1基因。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种提高小麦对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法及抗除草剂小麦。该方法，通过在小麦中过表达水稻OsHIS1基因，使小麦对HPPD抑制剂类除草剂产生抗性，包括1.构建过表达载体pUBI‑OsHIS1；2.通过转基因方式进行pUBI‑OsHIS1的转入；3.通过PCR检测确定转基因阳性株系；4.通过HPPD抑制剂类除草剂对转基因幼苗的喷施，筛选具有除草剂抗性的阳性苗。该发明，可提高小麦田的杂草管理效率，降低除草成本，还不影响小麦的正常生长和产量。

技术研发人员：李停栋,吉万全,赵晨旭,邓平川,陈春环
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21