用于空间转录组学测序的芯片及其制备方法、空间转录组学测序方法与流程

本发明属于基因测序，具体地，本发明涉及一种用于空间转录组学测序的芯片及其制备方法、空间转录组学测序方法。

背景技术：

1、近年来，主要发达国家(例如美国、英国、法国等)都陆续将基因技术作为国家战略，而空间组学更是时下研究的热点。空间组学技术通过对组织转录组的原位表征，为细胞分型、细胞状态表征、细胞-细胞相互作用提供重要的生物信息支持。在神经科学、肿瘤微环境研究、免疫学和疾病标志物寻找等多个生物医学领域具有广泛应用。目前的空间组学技术主要通过用poly-t序列，捕获携带poly-a尾的mrna分子，实现对空间转录组的全面表征，但其对mrna分子的捕获效率存在一定的局限性，会造成一些目标分子的丢失。

2、因此，亟需开发一种可同时实现靶向和非靶向捕获的空间转录组学芯片和方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种可同时实现靶向和非靶向捕获的空间转录组学芯片，本发明的空间转录组学芯片可同时实现靶向和非靶向捕获，尤其是可捕获不含poly-a尾的rna。

2、本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

3、传统的空间转录组学技术主要是采用poly-t序列捕获携带poly-a尾的mrna分子，实现对空间转录组的全面表征。但传统的空间转录组学技术中，由于mrna在样本转录过程中极易降解、且受限于组织处理方式，其对mrna分子的捕获效率存在局限性，会造成了重要目标分子的丢失。并且，针对不含poly-a尾的mrna(如原核生物mrna(细菌mrna)、其他rna(如rrna，lncrna)等)，传统的空间转录组学技术无法捕获其mrna进行表征，这使得肠道微生物的相关研究中的肠道-微生物空间图谱共建面临困难。

4、然而，本发明基于二代测序技术，在测序芯片表面利用桥式扩增形成携带空间编码序列的dna点阵(或称寡核苷酸簇)，然后同时连接目标分子的互补序列探针和poly-t探针，其可对mrna实现非靶向全面捕获的同时，还可对特定目标分子实现靶向捕获。

5、基于此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种芯片。根据本发明的实施例，所述芯片包括：芯片基底、靶向探针和poly-t探针；其中，所述芯片基底上含有多个寡核苷酸序列，多个所述寡核苷酸序列各自独立地与所述靶向探针和poly-t探针相连；所述靶向探针的序列的至少部分与待结合基因序列互补配对。本发明的芯片除了可全面捕获含poly-a尾的mrna，还可以对特定目标分子的核苷酸序列，从而可同时实现靶向和非靶向捕获。

6、根据本发明的实施例，所述待结合基因序列包括dna、lncrna、mrna和rrna中的至少之一。

7、根据本发明的实施例，所述待结合基因序列为不含poly-a尾部的rna。

8、根据本发明的实施例，所述芯片基底上，所述靶向探针和poly-t探针的数量比为(0.1～2)：(1～2)。

9、根据本发明的实施例，所述芯片基底上，所述靶向探针和poly-t探针的数量比为(0.1～0.2)：(1～2)。

10、根据本发明的实施例，所述芯片基底上，所述靶向探针和poly-t探针的数量比为(0.2～2)：(1～2)。

11、根据本发明的实施例，所述靶向探针和/或poly-t探针通过磷酸二酯键与所述寡核苷酸序列相连。

12、根据本发明的实施例，所述寡核苷酸序列从5’端到3’端依次包括接头序列1、测序引物、空间编码序列、空间编码序列测序引物和接头序列2。

13、根据本发明的实施例，所述靶向探针和/或poly-t探针的5’端与所述接头序列2的3’端相连。

14、根据本发明的实施例，所述接头序列1的5’端和所述芯片基底相连。

15、在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备芯片的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将靶向探针和poly-t探针与含有多个寡核苷酸序列的芯片基底进行连接处理，以便获得所述芯片；其中，所述靶向探针的序列的至少部分与待结合基因序列互补配对。本发明的制备方法简单，制备得到的芯片除了可全面捕获含poly-a尾的mrna，还可以对特定目标分子的核苷酸序列，从而可同时实现靶向和非靶向捕获。

16、根据本发明的实施例，所述待结合基因序列包括dna、lncrna、mrna和rrna中的至少之一。

17、根据本发明的实施例，所述待结合基因序列为不含poly-a尾部的rna。

18、根据本发明的实施例，所述寡核苷酸序列从5’端到3’端依次包括接头序列1、测序引物、空间编码序列、空间编码序列测序引物和接头序列2。

19、根据本发明的实施例，所述多个寡核苷酸序列是通过pcr扩增处理后获得的，所述pcr扩增处理中，以接头序列1为引物，以所述寡核苷酸序列的互补链为模板。

20、根据本发明的实施例，所述pcr扩增处理之后、所述连接处理之前，预先将所述寡核苷酸序列进行空间编码测序，获得所述含有多个寡核苷酸序列的芯片基底的每个寡核苷酸序列的空间坐标。

21、根据本发明的实施例，所述连接处理是通过如下方式进行的：将引导序列、聚合酶或连接酶、所述靶向探针和poly-t探针与所述含有多个寡核苷酸序列的芯片基底进行混合反应；将混合反应产物进行变性处理，以便获得所述芯片。

22、根据本发明的实施例，所述混合反应是在35～38℃条件下反应0.5～12h。

23、根据本发明的实施例，所述聚合酶或连接酶的添加量为3～5u/μl。

24、根据本发明的实施例，所述引导序列、靶向探针和poly-t探针的摩尔比为(1～2)：(0.1～2)：(1～2)。

25、根据本发明的实施例，所述引导序列包括互补序列1和连接序列1，所述互补序列1的至少部分与所述接头序列2的至少部分互补配对，所述连接序列1的至少部分与所述靶向探针和/或poly-t探针的至少部分互补配对。

26、根据本发明的实施例，所述靶向探针和/或poly-t探针包括连接序列2和靶向序列和/或poly-t序列，所述连接序列2的3’端与所述靶向序列和/或poly-t序列的5’端相连，所述连接序列2的至少部分与所述连接序列1的至少部分互补配对。

27、在本发明的第三方面，本发明提出了一种空间转录组学测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用第一方面所述的芯片或依据第二方面所述方法获得的芯片对待测组织样本进行空间转录组学测序。有前可知，第一方面所述的芯片或依据第二方面所述方法获得的芯片可全面捕获含poly-a尾的mrna和特定目标分子的基因序列，因此，采用本发明的方法可同时实现靶向和非靶向捕获，尤其是目标分子(例如稀有细胞类型标志物、组织样本中的细菌)，可以通过靶向探针捕获以突破poly-t捕获效率的限制。

28、根据本发明的实施例，所述待测组织样本预先进行切片处理。

29、根据本发明的实施例，所述空间转录组学测序是通过如下方式进行的：将所述待测组织样本与所述芯片上的靶向探针和/或poly-t探针进行接触处理；将接触处理产物依次进行组织固定处理和组织透化处理；将组织透化处理产物依次进行逆转录处理和rna变性移除处理；将rna变性移除处理产物依次进行第二链延伸反应和洗脱处理，以便得到第二链，所述第二链序列包含待结合基因序列的信息；将所述第二链进行建库及测序处理；将所述建库及测序处理得到的数据进行分析，以便获得待测样本的空间转录图谱或待结合基因序列宿主的空间分布图谱。

30、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。