一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白随机突变体库及应用

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白随机突变体库及应用。

背景技术：

1、纤维小体是在厌氧微生物中发现的一种天然的多酶复合物，主要由两部分组成：含有酶或其他辅助蛋白的对接蛋白dockerin(doc)，具有催化作用；含有结构蛋白的黏连蛋白cohesin(coh)，也被称为脚手架蛋白scaffoldin(sca)、支架蛋白cellulose integratedproteina(cipa)，具有组装作用，参见文献[wang,international journal molecularsciences，2019，20：13；hirano,scientific reports，2016，6：35709]。该纤维小体的每种酶具有单个doc模块和至少一个非酶支架组分。

2、热纤梭菌c.thermocellum中的纤维小体是研究最广泛和最典型的纤维小体模型，它的形成是由两种特定的相互作用介导的：一种相互作用是在纤维小体c端ⅰ型对接蛋白doc模块和主要支架蛋白cipa内部的9个ⅰ型黏连蛋白coh模块之间的相互作用；另一种相互作用是在cipa的c端细胞表面显示未结合的二级支架蛋白的内部ⅱ型coh模块与ⅱ型对接蛋白doc模块之间的相互作用。主要由三部分组成：含酶i型doc蛋白、一级支架蛋白和锚定支架蛋白，参见文献[fontes,annual review of biochemistry，2010，79：655-681]。纤维小体作为一种天然高效的多酶自组装系统，已成功地展示在细菌、酵母和其他微生物的细胞外表面，参见文献[barth,proceedings of the national academy ofsciences of theunited states of america，2018，115：11274-11283；fan,proceedings of the nationalacademy ofsciences of the united states of america，2012，109：13260-13265；fan,process biochemistry，2013，48：430-437]。关于多种酶的细胞内组装表达报道极少。

3、现有技术发现对于厌氧菌而言，ca2+对doca蛋白的结构稳定性和功能完整性起着重要作用。现有研究发现，厌氧菌的doca在与edta螯合ca2+后，不再与coh相互作用，参见文献[betsy,archives of biochemietry and biophysics，2000，379：237-244]。现有技术中细胞外doca和coh相互作用以实现高效的自组装需要一定浓度ca2+的存在，参见文献[bule,journal of biological chemistry，2018，293：4201-4212；xu,biotechnology forbiofuels，2013，6：126]。但由于ca2+通道等成分的严格控制，微生物细胞内静态ca2+浓度一般仅为1.00×10-7mol/l，远低于胞外浓度(1.00×10-3mol/l)，这限制了doca和coh在细胞内的相互作用和自组装。

4、现有技术无法提供能够在10-7m～10-6m条件下能够有效组装的纤维小体元件，也无法提供在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10-7m～2mm)中都能发挥作用的纤维小体元件，更无法提供能够在生物细胞内(钙离子浓度≤10-6m)组装的纤维小体元件。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白随机突变体库及应用。

2、发明人发现将对接蛋白doca中d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45的8个位点随机突变，可以改变来自于不同产生物种的doc和coh在细胞内相互之间的亲和能力。

3、本发明提供的突变体，解决了现有纤维小体元件在低钙离子浓度下(如细胞内)无法自组装的问题，提供了一种在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10-7m～2×10-3m)发挥作用的纤维小体对接蛋白突变体库。

4、上述d为天冬氨酸，n为天冬酰胺，t为苏氨酸，s为丝氨酸，f为苯丙氨酸，v为缬氨酸，r为精氨酸，y为酪氨酸；数字代表该位点处于该序列中的第几位。

5、本发明涉及的技术方案如下：

6、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白随机突变体库，所述突变体库为在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为在d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45的8个位点随机突变，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。

7、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m62，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为f5、r7、v9、f11、f39、y41、f43和y45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。

8、上述对接蛋白突变体doca-m62的编码基因，所述编码基因为根据上述对接蛋白doca氨基酸的突变位点在对接蛋白doca的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白doca的核苷酸序列的如seq id no.1所示。

9、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m51，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为s5、n7、f9、c11、y39、h41、y43和k45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。

10、上述对接蛋白突变体doca-m51的编码基因，所述编码基因为根据上述对接蛋白doca氨基酸的突变位点在对接蛋白doca的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白doca的核苷酸序列的如seq id no.1所示。

11、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m53，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为p5、i7、g9、r11、r39、l41、m43和r45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。

12、上述对接蛋白突变体doca-m53的编码基因，所述编码基因为根据上述对接蛋白doca氨基酸的突变位点在对接蛋白doca的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白doca的核苷酸序列的如seq id no.1所示。

13、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m61，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为t5、k7、i9、y11、n39、l41、y43和f45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。

14、上述对接蛋白突变体doca-m61的编码基因，所述编码基因为根据上述对接蛋白doca氨基酸的突变位点在对接蛋白doca的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白doca的核苷酸序列的如seq id no.1所示。

15、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m65，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为y5、s7、i9、s11、f39、n41、v43和v45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。

16、上述对接蛋白突变体doca-m65的编码基因，所述编码基因为根据上述对接蛋白doca氨基酸的突变位点在对接蛋白doca的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白doca的核苷酸序列的如seq id no.1所示。

17、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m66，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为f5、s7、y9、f11、i39、l41、r43和r45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。

18、上述对接蛋白突变体doca-m66的编码基因，所述编码基因为根据上述对接蛋白doca氨基酸的突变位点在对接蛋白doca的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白doca的核苷酸序列的如seq id no.1所示。

19、上述突变位点中的数字代表该位点处于该序列中的第几位。

20、上述纤维小体对接蛋白突变体在与黏连蛋白相互作用构建蛋白复合体中的应用，所述黏连蛋白的氨基酸序列如seq id no.8所示。

21、根据本发明优选的，所述对接蛋白突变体与黏连蛋白在10-7m～10-6m钙离子浓度下相互作用构建蛋白复合体中的应用。

22、所述的纤维小体对接蛋白能够特异性的与纤维小体黏连蛋白发生结合。

23、所述的纤维小体黏连蛋白不含有钙离子结合位点，其活性结构的形成不需要钙离子的支持。

24、本发明的有益效果如下

25、1、本发明提供的纤维小体对接蛋白突变体库降低纤维小体关键元件对接蛋白对于钙离子的依赖需求，实现在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10-7m～2×10-3m)下对纤维小体黏连蛋白的有效结合，并且实现了钙离子浓度在10-7m～10-6m条件下能够与纤维小体黏连蛋白有效组装。

26、本发明涉及随机突变位点在胞内低钙离子的情况下也可以使纤维小体对接蛋白突变体形成特定构象，并与纤维小体黏连蛋白发生相互作用，完成整个纤维小体的组装；并且在可以在细胞内相互作用组装，是本领域技术人员预料不到的。

27、2、本发明提供的纤维小体对接蛋白突变体实现了在细胞内与纤维小体黏连蛋白的有效组装。

28、3、本发明为细胞内多酶复合体的组装提供了新的方法和途径，具有广泛的应用前景。