一种MSC成球培养基及培养方法与流程

本发明属于干细胞培养，涉及一种msc的培养方法及培养基。

背景技术：

1、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）是具有自我更新、多向分化潜能的干细胞，mscs能够分泌大量生物活性因子，这些因子可以通过旁分泌的方式作用于邻近的细胞，在关键的生物学过程的调节中起着重要作用，可以增强细胞的增殖、迁移、血管生成，并具有抗凋亡和抗炎症的作用，因此在组织修复和多系统疾病治疗中具有良好的应用前景。

2、传统的间充质干细胞体外培养方式为二维平面的单层贴壁培养，这种培养方式占地面积大，人力成本高，且往往无法模拟细胞在体内的三维环境。与贴壁培养相比，借助生物反应器的三维细胞培养 对生产场地的要求比传统的2d低，且占用场地面积大幅降低，并能不同程度的节省设备、人力及检测成本，批产量提高，能更好的满足临床需求，且能可以更好地模拟体内微环境，对于细胞生长、分化以及细胞间相互作用的研究具有重大意义。

3、目前的间充质干细胞三维培养体系主要分为：（1）借助于水凝胶进行间充质干细胞培养，主要用于组织工程中，如促进伤口愈合。（2）借助微载体，使细胞在微载体表面贴壁，增殖，普遍存在细胞得率低，或细胞产品微载体残留量高的问题。（3）细胞自发聚集成细胞球，主要包括悬滴法、低吸附涂层培养法，芯片法等，难以实现规模化生产。

4、中国专利cn 111334466a中，公开了间充质干细胞球及其制备方法和应用以及成球培养基在制备间充质干细胞球中的应用，通过改良培养基配方，使二维贴壁生长的细胞自发聚集成球状，但是使用该方法细胞初始接种密度高，借助传统二维培养瓶，细胞成球速度慢，难以实现大规模生产；而且也没有增加间充质干细胞在成血管、抗炎等临床功能上的能力。

技术实现思路

1、针对目前msc成球培养中的问题，本发明提供一种msc成球培养基，初始密度低、成球速度快。

2、本发明的另一目的是提供一种利用上述msc成球培养基培养msc细胞的方法。

3、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

4、一种msc成球培养基，在msc完全培养基中添加以下浓度的成分：

5、10ng/ml-50ng/ml血管内皮生长因子（vegf）、10ng/ml-50ng/ml角质形成细胞生长因子（kgf）和1ng/ml-10ng/ml二甲双胍。

6、所述msc完全培养基可以选择已公开的用于msc培养的培养基。

7、所述msc为哺乳动物来源的，如大鼠、小鼠、猪、猴、人；优选为人源的。为了避免msc中有潜在病原或异种物质排斥，msc完全培养基为添加同物种血清甚至血清替代物的完全培养基；在优选的实施例中，所述血清替代物为商业购买的ultragrotm-advanced，其添加浓度可以按照说明进行，如按照培养基4%-5%体积分数添加。

8、一种msc的培养方法，包括以下步骤：

9、（1）获得原代msc；

10、（2）将原代msc接种至上述msc成球培养基中，培养获得继代msc细胞球；

11、（3）将继代msc细胞球消化成单细胞悬液，然后在接种至上述msc成球培养基中传代。

12、所述原代msc的来源并无特别限定，可以是一切可以分离获得间充质干细胞的组织或器官。如，脐带血、脐带组织、脂肪、骨髓，牙髓等。所述原代msc还可以是为了实现临床治疗或永生化目的进行改造后的。所述改造可以是通过转染病毒或其他公知的方法进行基因改造，所述基因改造包括但不限于对某些功能基因进行敲减、敲除、增加或过表达。所述原代msc可以是由相关组织、器官分离获得的，也可以是由直接分离的msc继代培养1-15次获得的。

13、接种浓度可以为每毫升培养基接种104-105数量级的细胞，如1×104个细胞/ml、5×104个细胞/ml、8×104个细胞/ml、1×105个细胞/ml、2×105个细胞/ml、3×105个细胞/ml、4×105个细胞/ml、5×105个细胞/ml、9×105个细胞/ml。在一些实施例中，接种密度为5×104-5×105个细胞/ml。

14、为了使msc细胞球提高内部和外部的细胞均一性或提高培养器皿内的导热或传质、提高同批次msc细胞球的均一性，培养过程进行搅拌，搅拌的速度可以按照细胞培养的周期和需要的细胞球的大小获得，如较高的搅拌速度下获得的细胞球较小。在一些实施例中，搅拌的速度为30转/分钟（rpm）-200转/分钟；具体的，可以选择30rpm、50rpm、80rpm、90rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm。

15、一种利用上述msc成球培养基或培养方法制备的msc细胞球。细胞球大小为50-500μm左右，细胞活率不小于90%；相比msc完全培养基，具有较好的三系分化潜能、成血管能力、抗炎能力，且具有较高的pge2分泌水平。

16、本发明具有以下优点：

17、本发明利用特定的成球培养基对间充质干细胞进行成球培养，细胞能在较低的细胞初始密度（1×105个细胞/ml）下，在培养24h内细胞可自发成球，成球速度快，培养5-7天后可收获细胞。此外，本发明优选的成球培养基中不含有动物源性成分，有助于临床应用。在成球培养基内msc扩增倍数高，还可利用生物反应器的培养方式，实现规模化生产。相较贴壁培养模式，获得的间充质干细胞增殖能力、三系分化能力和成血管能力好，pge2蛋白的表达提高，抗炎能力强。间充质干细胞的成球培养能够提高单位容积中细胞密度、使其能更好地实现大规模生产，并更好地发挥其临床功能。

技术特征：

1.一种msc成球培养基，其特征在于，在msc完全培养基中添加以下浓度的成分：

2.根据权利要求1所述的msc成球培养基，其特征在于，所述msc为哺乳动物来源。

3.根据权利要求1所述的msc成球培养基，其特征在于，所述msc来源为大鼠、小鼠、猪、猴或人；优选为人源。

4.根据权利要求1所述的msc成球培养基，其特征在于，msc完全培养基为添加同物种血清或血清替代物的；

5.一种msc的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，原代msc的来源选自脐带血、脐带组织、脂肪、骨髓和牙髓中的任意一种；

7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，原代msc是由相关组织、器官直接分离获得的，或，由直接分离的msc继代培养1-15次获得的。

8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，接种浓度为每毫升培养基接种104-105数量级的细胞；如，1×104个细胞/ml、5×104个细胞/ml、8×104个细胞/ml、1×105个细胞/ml、2×105个细胞/ml、3×105个细胞/ml、4×105个细胞/ml、5×105个细胞/ml、9×105个细胞/ml；优选的，接种密度为5×104-5×105个细胞/ml。

9.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，培养过程进行搅拌，搅拌的速度为30rpm-200rpm；如，30rpm、50rpm、80rpm、90rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm或200rpm。

10.一种利用如权利要求1-4任一所述的msc成球培养基或如权利要求5-9任一所述的培养方法制备的msc细胞球，其特征在于，细胞球大小为50μm-500μm，细胞活率不小于90%。

技术总结
本发明属于干细胞培养技术领域，提供了一种MSC的培养方法及培养基。所述MSC成球培养基是在MSC完全培养基中添加以下10ng/mL‑50ng/mL VEGF、10ng/mL‑50ng/mL KGF和1ng/mL‑10ng/mL二甲双胍。利用该成球培养基制备的MSC细胞球，大小为50‑500μm左右，细胞活率不小于90%。本发明提供的成球培养基能提高单位容积中细胞密度、提高MSC扩增倍数，利用生物反应器的培养方式使其能更好地实现大规模生产，获得的MSC具有较好的三系分化潜能、成血管能力、抗炎能力，且具有较高的PGE2分泌水平，能够更好地发挥其临床功能。

技术研发人员：韩娟娟,马贺然,谭毅,车丽娜,王玉森
受保护的技术使用者：山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29