一种改造成识别甲氧基修饰的DNA聚合酶突变体的方法

本发明属于基因工程，具体涉及改造成识别甲氧基修饰的dna聚合酶突变体的方法，更具体改造成具有c2’-ome-dna合成活性的dna聚合酶突变体的方法及所制备的具有c2’-ome-dna合成活性的dna聚合酶突变体及其应用。

背景技术：

1、在自然界中生物体利用dna或者rna作为遗传信息的载体，而dna聚合酶承担遗传信息的流通的功能。随着对dna或者rna研究的深入，dna或者rna被用于分子生物学、医学等领域中，成为医学检测以及疾病治疗的有力工具。

2、但是，天然存在的dna或者rna极易被核酸酶降解，这大大阻碍了其进一步的应用。研究表明，对dna或者rna的糖环进行修饰能够极大提高对核酸酶的抵抗，c2’-ome修饰是比较常见的修饰。c2’-ome-dna表现出优良的稳定性，这在疾病治疗以及成为生物材料等应用上具有巨大的优势。然而，c2’-ome-dna难以被天然dna聚合酶识别，因此，c2’-ome-dna的转录及其逆转录也难以进行。通过对天然dna聚合酶进行改造使其具有识别c2’-ome修饰的活性是当下研究的热点。

技术实现思路

1、目前，根据氨基酸序列相似性将dna聚合酶分为7个家族。分别为a、b、c、d、x、y、rt家族(kuznetsova aa,fedorova o s,kuznetsov n a.structural and molecularkinetic features of activities of dna polymerases[j].int j mol sci,2022,23(12)；hubscher u,maga g,villani g,et al.dna polymerases discovery,characterization and functions in cellular dna transactions；brenner’s；illustrated edition；world scientific publishing company:singapore,2013；isbn9814299162)。每个家族内各成员的氨基酸序列相似度较高。对于dna聚合酶进行改造使其能够识别c2’-ome修饰集中在a家族如taq dna聚合酶，b家族如kod dna聚合酶等。其他家族的dna聚合酶的改造工作较少。研究表明，在dna聚合酶内部存在被称为“空间门”的氨基酸残基(brown j a,suo z.unlocking the sugar"steric gate"of dna polymerases[j].biochemistry,2011,50(7):1135-42)，在生理上起到分辨脱氧核糖核苷酸和和核糖核苷酸，防止核糖核苷酸掺入到dna链中，破坏dna的稳定的作用。因此，本发明通过结构分析，发现将作为空间门的氨基酸残基突变为小侧链的氨基酸残基，能够将其他家族的dna聚合酶也改造成比各自野生型具有更高效率的能够合成c2’-ome-dna的dna聚合酶突变体。

2、在该方案中是将作为空间门的氨基酸残基突变为小侧链的氨基酸残基，该方案所针对的dna聚合酶家族涉及c、d、y、rt dna聚合酶家族，并且本发明随机挑选上述四个家族的dna聚合酶的一个成员进行了验证，分别挑选的是c家族的polc(来源：geobacilluskaustophilus)、d家族的pold(来源：pyrococcus abyssi)、y家族的dpo4(来源：saccharolobus solfataricus)以及rt家族的hiv-1 rt(来源：human immunodeficiencyvirus type 1group m subtype b)。

3、目前对于空间门的分析是基于dna聚合酶的结构来判定的，分析方法如图1。空间门氨基酸位于c2’位置处(见图1)。c2’指的是核苷酸糖环上的2号碳。突变体的原理是将具有大侧链的空间门氨基酸突变成小侧链的氨基酸，这样小侧链的氨基酸就不会对c2’-ome基团产生阻碍。在c2’附近都含有空间门氨基酸，通过突变这个空间门氨基酸就能够识别c2’-ome修饰的核苷酸。

4、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

5、一方面，本发明提供改造成具有c2’-ome-dna合成活性的dna聚合酶突变体的方法，所述方法包括如下步骤：

6、a.通过结构分析，在进入dna聚合酶内部的核苷酸c2’位点附近寻找最近位置的氨基酸残基，所述氨基酸残基为具有较大侧链的氨基酸残基，例如组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸；

7、b.将dna聚合酶的所述具有较大侧链的氨基酸残基突变为具有较小侧链的氨基酸残基，所述具有较小侧链的氨基酸残基例如为甘氨酸、丙氨酸，从而获得dna聚合酶突变体。

8、在一些实施方案中，所述结构分析是对所述核苷酸和所述dna聚合酶的空间结构进行分析。

9、在一些实施方案中，所述核苷酸和所述dna聚合酶的空间结构通过查阅文献获得，例如vaisman a,ling h,woodgate r,et al.fidelity of dpo4:effect of metal ions,nucleotide selection and pyrophosphorolysis[j].the embo journal,2005,24(17):2957-67；evans r j,daviesd r,bullard j m,et al.structure of polc revealsunique dna binding and fidelity determinants[j].proc natl acad sci u s a,2008,105(52):20695-700；madru c,henneke g,raia p,et al.structural basis forthe increased processivity of d-family dna polymerases in complex with pcna[j].nat commun,2020,11(1):1591；huang h,chopra r,verdine g l,et al.structureof a covalently trapped catalytic complex of hiv-1reverse transcriptase:implications for drug resistance[j].science,1998,282(5394):1669-75。

10、在一些实施方案中，所述核苷酸和所述dna聚合酶的空间结构通过x射线晶体衍射或者冷冻电镜获得。

11、另一方面，本发明提供通过如上所述的方法获得的dna聚合酶突变体。

12、在一些实施方案中，所述dna聚合酶突变体选自以下项：

13、a.c家族dna聚合酶突变体，其氨基酸序列如seq id no:1所示；

14、b.d家族dna聚合酶突变体，其大亚基的氨基酸序列如seq id no:2所示，小亚基的氨基酸序列如seq id no:3所示；

15、c.dpo4 dna聚合酶突变体，其氨基酸序列如seq id no:4所示；

16、d.hiv-1 rt dna聚合酶突变体，其大亚基的氨基酸序列如seq id no:5所示，小亚基的氨基酸序列如seq id no:6所示。

17、在一些实施方案中，所述dna聚合酶突变体选自以下项：

18、a.c家族dna聚合酶突变体，其核苷酸序列如seq id no:7所示；

19、b.d家族dna聚合酶突变体，其大亚基的核苷酸序列如seq id no:8所示，小亚基的核苷酸序列如seq id no:9所示；

20、c.dpo4 dna聚合酶突变体，其核苷酸序列如seq id no:10所示；

21、d.hiv-1 rt dna聚合酶突变体，其大亚基的核苷酸序列如seq id no:11所示，小亚基的核苷酸序列如seq id no:12所示。

22、另一方面，本发明提供组合物，其包含如上所述的dna聚合酶突变体。

23、另一方面，本发明提供多核苷酸，其编码如上所述dna聚合酶突变体。

24、另一方面，本发明提供表达载体，其表达如上所述的dna聚合酶突变体。

25、另一方面，本发明提供宿主细胞，其表达如上所述的dna聚合酶突变体，所述宿主细胞优选为原核细胞，更优选大肠杆菌感受态细胞e.coil bl21。

26、另一方面，本发明提供试剂盒，其包含如上所述的taq dna聚合酶突变体。

27、另一方面，本发明提供pcr扩增方法，其包括使用如上所述的dna聚合酶突变体或如上所述的试剂盒进行pcr扩增。

28、另一方面，本发明提供制备权利要求如上所述的dna聚合酶突变体的方法，其包括培养如上所述的宿主细胞并诱导表达dna聚合酶突变体，分离出所述dna聚合酶突变体。

29、在一些实施方案中，其中所述dna聚合酶突变体的分离包括收集宿主细胞，破碎细胞，离心，收集上清液并用于亲和纯化，优选镍柱亲和纯化后进行肝素亲和纯化。

30、本发明的一个目的是以上述四种dna聚合酶家族的代表成员为例提供来自于上述四种dna聚合酶家族的dna聚合酶成员的空间门识别核苷酸c2’位点的结构特征。

31、本发明的另一目的是提供上述的c家族dna聚合酶代表polc dna聚合酶突变体的氨基酸序列，其氨基酸序列如seq id no:1所示。

32、本发明的另一目的是提供上述的d家族dna聚合酶代表pold dna聚合酶突变体的氨基酸序列，其氨基酸序列如seq id no:2(大亚基)、seq id no:3(小亚基)所示。

33、本发明的另一目的是提供上述的dpo4 dna聚合酶突变体的氨基酸序列，其氨基酸序列如seq id no:4所示。

34、本发明的另一目的是提供上述的hiv-1 rt dna聚合酶突变体的氨基酸序列，其氨基酸序列如seq id no:5(大亚基)、seq id no:6(小亚基)所示。

35、本发明的另一目的是提供编码上述polc dna聚合酶突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no:7所示。

36、本发明的另一目的是提供编码上述pold dna聚合酶突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no:8(编码大亚基)、seq id no:9(编码小亚基)所示。

37、本发明的另一目的是提供编码上述dpo4 dna聚合酶突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no:10所示。

38、本发明的另一目的是提供编码上述hiv-1 rt dna聚合酶突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no:11(编码大亚基)和seq id no:12(编码小亚基)所示。

39、本发明的另一目的是提供制备上述dna聚合酶突变体的方法，具体步骤如下：

40、(1)克隆上述的核苷酸序列；

41、(2)将步骤(1)中的核苷酸片段构建到基因表达载体中，形成重组质粒；

42、(3)将重组质粒转化到宿主细胞中，得到重组细胞；

43、(4)对步骤(3)中的重组细胞进行诱导表达，收集菌体；

44、(5)破碎步骤(4)中菌体，离心，收集上清；

45、(6)利用镍柱亲和纯化步骤(5)上清，收集产物；

46、(7)利用heparin亲和纯化步骤(6)，得到上述的dna聚合酶突变体。

47、在一些实施方案中，步骤(2)中基因表达载体为pet-22b。

48、在一些实施方案中，步骤(3)中宿主细胞为原核细胞。

49、在一些实施方案中，步骤(3)中宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞e.coil bl21。

50、在一些实施方案中，步骤(4)中诱导表达方法为：将步骤(3)中重组细胞于5ml lb液体培养基中于37℃200rpm过夜培养后，转接到800ml lb液体培养基中，37℃200rpm培养至od600为0.6-0.8时，加入iptg至终浓度为0.4mm，30℃，200rpm诱导12h。

51、最后，本发明提供了上述dna聚合酶突变体的应用，所述的dna聚合酶突变应用于转录c2’-ome-dna反应。

52、定义

53、c2’-ome修饰：在脱氧核苷核苷酸的基础上在糖环的2号碳添加甲氧基。

54、空间门氨基酸残基：位于进入聚合酶内部的核苷酸c2’位点附近最近位置的氨基酸残基，具有分辨脱氧核糖核苷酸和其他c2’修饰的核苷酸的功能。通过结构分析，寻找c2’位点附近最近位置的氨基酸残基。

55、c2’位点：dna是由脱氧核糖核苷酸形成的，c2’位点位于脱氧核糖核苷酸上，因此本发明的突变体能够将含有c2’-ome修饰的脱氧核糖核苷酸合成含有c2’-ome修饰的dna链。

56、聚合酶：又称多聚酶，是专门生物催化合成dna和rna的一类酶的统称。可以分为以下几个类群：(1)依赖dna的dna聚合酶；(2)依赖rna的dna聚合酶；(3)依赖dna的rna聚合酶；(4)依赖rna的rna聚合酶。前两者是dna聚合酶，它使dna复制链按模板顺序延长。dna聚合酶只能在有引物的基础上，即在dna或rna的3'-oh延伸。换言之，dna聚合酶催化反应除底物(dntp)外，还需要mg2+、模板和引物。

57、pold dna聚合酶：研究显示，该酶由大小两个亚基组成一个整体，形成一个整体后活性会更好。大小亚基的主要功能不同，大亚基主要是合成功能，小亚基主要是校准。

58、dpo4 dna聚合酶：全称硫磺矿硫化叶菌的dna聚合酶iv(dna polymerase iv ofsulfolobus solfataricus)，是一种热稳定的y家族dna聚合酶，能在复制过程中绕过dna损伤，因而能以多种损伤dna为模板合成dna。

59、hiv-1 rt dna聚合酶：研究显示，该酶由大小两个亚基组成一个整体，形成一个整体后活性会更好。大小亚基的主要功能不同，大亚基主要是合成功能，小亚基主要是校准。

60、核苷：核苷是戊糖与碱基缩合而成的。糖的第一位碳原子与嘧啶的第一位氮原子或嘌呤的第九位氮原子以n-糖苷键相连。戊糖是呋喃环，c1是不对称碳原子，核酸中的糖苷键都是β糖苷键。碱基与糖环平面互相垂直。

61、有益效果

62、本发明通过结构分析提供了一种通用的突变方案，即通过将空间门氨基酸残基突变为小侧链的氨基酸如甘氨酸或丙氨酸，使得突变体相比于野生型提高了合成c2’-ome-dna的能力。该方案适用于所有含有空间门氨基酸残基的c、d、y、rt家族dna聚合酶成员，大大丰富了能够合成c2’-ome-dna的dna聚合酶的种类。突变后的dna聚合酶能够用于需要转合成c2’-ome-dna链的场景。