一种减毒的百日咳杆菌重组菌株及其构建方法和应用与流程

本发明属于百日咳毒素基因遗传脱毒，具体涉及一种减毒的百日咳杆菌重组菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、百日咳毒素(pertussis toxin，pt)是鲍特氏菌属百日咳杆菌所产生的一种主要毒力因子，其为具有a-b结构的细菌毒素，由s1、s2、s3、s4、s5亚基以1:1:1:2:1组成，其中a原体由s1亚基构成，b寡聚体由s2、s3、s4、s5构成。百日咳毒素的a原体和b寡聚体分别具有不同的生物学功能。a原体具有adp-核糖基转移酶活性，能够将二磷酸腺苷核糖进行催化转移至gtp-结合蛋白c末端的半胱氨酸残基上gtp-结合蛋白可阻断腺苷酸环化酶与受体结合，导致细胞内camp(环磷酸腺苷)增多产生诸多生物学效应，如组胺致敏、白细胞增多和胰岛素分泌等。b寡聚体是一种无毒性的低聚体，与真核细胞表面的各种受体结合，通过内吞作用介导有毒的s1亚基到达其细胞内的靶蛋白。atp(三磷酸腺苷)与b寡聚体的相互作用可以导致s1亚基转移至细胞质基质，并在内质网中释放，同时在细胞膜上发生易位之前介导全毒素分离。有研究表明，百日咳毒素的b寡聚体可作为免疫增强剂激活并调节免疫应答。

2、百日咳毒素是目前可用疫苗的主要成分，且该毒素抗体的存在与保护儿童免受百日咳疾病相关。由于百日咳毒素具有诸多生物学活性，纳克级别未脱毒的pt注射实验动物后，可引起外周血白细胞增高、组胺致敏、血管活性物质过敏性增强等反应。因此，百日咳毒素须进行脱毒后方可用于疫苗的制备。

3、目前对pt脱毒的方式主要分为化学脱毒和遗传脱毒。化学脱毒所采用的脱毒剂主要有甲醛和戊二醛，也有使用过氧化氢脱毒的。遗传脱毒是通过基因工程方法在pt中引入突变体，通常使pt的s1亚基获得点突变，从而大幅度减少了毒性但保留其免疫原性。由于化学脱毒pt改变了pt蛋白整体构象，影响其血清学抗体水平，目前开发出的疫苗无法长期持续有效地控制疾病，因此，有必要开发遗传脱毒的方法，为百日咳新疫苗的研发奠定基础。

技术实现思路

1、本发明提供一种减毒的百日咳杆菌重组菌株。该重组菌株以野生型百日咳杆菌cs株为背景进行改造得到，其具有卡那霉素抗性，其表达的百日咳毒素与who第1代百日咳毒素标准品jnih-5相比，毒性更低。

2、目前已有遗传脱毒pt的重组菌株常见于欧美百日咳tohama株pt-s1亚基r9k/e129g突变获得，亦有采用副百日咳杆菌、支气管败血杆菌经基因编辑后得到。本发明中野生型百日咳杆菌来自于中国百日咳疫苗生产用cs株，其pt-s1亚基天然与tohama株在194位氨基酸不同(cs株194位为甲硫氨酸，tohama株194位为异亮氨酸)。因此即使在cs株上完成相同位点的突变(例如r9k或e129g)，其效果也不全然与tohama株相同。鉴于cs株的独特性，其遗传脱毒重组菌株的构建具有重要意义。

3、具体地，本发明采用如下技术方案来实现上述目的：

4、所述百日咳杆菌重组菌株为通过将野生型百日咳杆菌cs株的百日咳毒素成熟s1亚基经过一个或多个氨基酸突变或s1亚基全长缺失而得到；所述百日咳杆菌重组菌株具有卡那霉素抗性；所述野生型百日咳杆菌cs株的百日咳毒素成熟s1亚基的氨基酸序列如seqid no.1所示。

5、在优选的实施方案中，所述百日咳杆菌重组菌株表达的百日咳毒素成熟s1亚基上包含有seq id no.1所示的氨基酸序列上的r9k和e129g双位点突变。

6、在进一步优选的实施方案中，所述百日咳杆菌重组菌株表达的百日咳毒素成熟s1亚基的氨基酸序列如seq id no.2所示。

7、在更进一步优选的实施方案中，所述百日咳杆菌重组菌株的基因组中包含seq idno.3所示的核苷酸序列或包含翻译后与seq id no.2所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的核苷酸序列。

8、本发明还提供所述百日咳杆菌重组菌株的构建方法，包括以下步骤：构建包含pt-s1亚基突变基因的重组质粒pb-kana-gs1，制备野生型百日咳杆菌cs株感受态细胞；将所述重组质粒pb-kana-gs1制备成包含pt-s1亚基突变基因的线性化dna重组片段，将所述包含pt-s1亚基突变基因的线性化dna重组片段电转至所述cs株感受态细胞，复苏，经卡那霉素抗性筛选，得到的阳性菌株即为pt-s1亚基基因突变的百日咳杆菌重组菌；

9、或制备野生型百日咳杆菌cs株感受态细胞，将pkd46质粒电转至所述cs株感受态细胞，得到含pkd46质粒的百日咳杆菌cs株，再将其制备成含pkd46质粒的感受态细胞；构建pt-s1亚基基因缺失的重组质粒pb-δs1；将所述重组质粒pb-δs1制备成不含pt-s1亚基基因的线性化dna重组片段，将所述不含pt-s1亚基基因的线性化dna重组片段电转至所述含pkd46质粒的感受态细胞，复苏，经卡那霉素抗性筛选，得到的阳性菌株即为pt-s1亚基基因缺失的百日咳杆菌重组菌株。

10、在优选的实施方案中，所述重组质粒pb-kana-gs1的构建方法包括以下步骤：以pbluescript ii sk(+)质粒为载体骨架，限制性酶切位点xhoi、bamhi为目的片段连接位点，通过基因合成将pt-s1亚基基因的5’同源臂、nos启动子、kana抗性基因、pt-s1亚基突变基因和pt-s1亚基基因的3’同源臂整合至所述pbluescript ii sk(+)质粒中得到。

11、在优选的实施方案中，所述重组质粒pb-δs1的构建方法包括以下步骤：以pbluescript ii sk(+)质粒为载体骨架，限制性酶切位点xhoi、bamhi为目的片段连接位点，通过基因合成将pt-s1亚基基因的5’同源臂、amp启动子、kana抗性基因和pt-s1亚基基因的3’同源臂整合至所述pbluescript ii sk(+)质粒中得到。

12、在优选的实施方案中，所述野生型百日咳杆菌感受态细胞的制备方法包括以下步骤：将野生型百日咳杆菌接种至stainer-scholte液体培养基，培养至od600nm＝0.5～0.7，收集菌体，用预冷至2～8℃的无菌双蒸水洗涤菌体后，再用预冷至2～8℃的10％(v/v)甘油洗涤2次，随后以每管100μl分装，-80℃保存。

13、在进一步优选的实施方案中，控制接种后所述ssm培养基中菌的终浓度为2亿cfu/ml。

14、在优选的实施方案中，电转时将80～120μl所述感受态细胞与1～4μg所述线性化dna重组片段混合。

15、在优选的实施方案中，所述电转的条件为：电击杯电极间距1mm，电容25μf，电阻200ω，电压2400v。

16、在优选的实施方案中，所述复苏是指将电转后得到的菌液加入到37℃预热的ssm培养基中，混匀，于35±2℃、220rpm条件下培养12～16小时。

17、在优选的实施方案中，所述经卡那霉素抗性筛选的步骤包括：将复苏后的菌液涂布于含有卡那霉素的15％羊血bordet-gengou抗性平板上，于35±2℃培养3～5天。

18、本发明中构建的百日咳杆菌重组菌株与who第1代百日咳毒素标准品jnih-5相比，表达的百日咳毒素的毒性更低，可以用于制备治疗或/和检测或/和预防百日咳疾病的产品。所述预防百日咳疾病的产品优选为百日咳疫苗。

19、本发明具有以下有益效果：(1)本发明中百日咳重组菌株构建采用电转导入线性dna重组片段，以完成目的基因的编辑改造。相比于传统利用大肠杆菌通过结合方式将重组质粒导入百日咳杆菌的方式，本发明中的核酸导入方式避免了大肠杆菌的引入和污染，同时导入的核酸为线性dna，在菌体中不会累积复制，未重组或重组之后随菌株代谢和传代逐步消失，不会污染遗传背景。(2)本发明中制备的百日咳杆菌重组菌株具有卡那霉素抗性，便于重组筛选；与野生型百日咳杆菌相比，重组菌株生长最大菌浓度更高。在cho细胞凝集实验中，通过pt多抗elisa双夹心法检测进行定量得出的结果可知，与who第1代百日咳毒素标准品jnih-5相比，分泌的pt蛋白的毒性更低。其中，百日咳毒素成熟s1亚基(pt-s1)上含有r9k单突变位点时，pt毒性下降至0.0081％；百日咳毒素成熟s1亚基(pt-s1)上含有r9k和e129g双位点突变时，pt毒性下降至0.0016％。当百日咳毒素s1亚基全长缺失时，pt多抗-elisa双抗体夹心法无法在培养上清中检测到pt蛋白含量，免疫印迹检测中s1亚基单克隆抗体1b7亦无法检测到条带。以上重组菌株可为百日咳cs株pt蛋白作用机制研究以及基因脱毒百日咳疫苗的研究奠定基础。