本发明属于生物技术及基因工程，具体涉及一种新型环状rna环化元件及载体，并进一步公开一种新型环装rna环化方法尤其是一步法环化方法。
背景技术：
：：1、随着mrna在医药治疗和疫苗开发领域取得显著的成功，mrna在稳定性上存在的显著缺陷也随之显露。为了克服mrna的稳定性缺点，circrna作为下一代mrna疫苗逐渐引起人们的关注。circrna由于其独特的共价闭合结构，使其能够免除外切核酸酶的消化，在体内体外具有更高的稳定性；同时，由于其独特的环形结构，也使其在翻译过程中利用核糖体循环增强了翻译效率，应用性能较强。2、目前，circrna的人工合成主要包括体内和体外法。体内法通常是指通过将dna转染进细胞中，然后转录过程中通过向后剪接或是其他机制产生circrna(chen,l.-l.theexpanding regulatory mechanisms and cellular functions of circularrnas.nat.rev.mol.cell biol.2020,21,475-490.)。然而，相比于体内法，体外合成circrna的方法更适合生物医药的应用，也更适合大规模的生产(liu,c.-x.；chen,l.-l.circular rnas:characterization,cellular roles,and applications.cell 2022,185,2016-2034.)。3、据报道，体外法合成circrna主要包含三种方式，即化学连接法、连接酶法以及核酶法。化学连接法是指通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)或是溴化氰(brcn)反应等化学反应进行rna末端连接形成circrna(dolinnaya,n.g.；sokolova,n.i.；ashirbekova,d.t.；shabarova,z.a.the use of brcn for assembling modified dnaduplexes and dna-rna hybrids；comparison with water-solublecarbodiimide.nucleic acids res.1991,19,3067-3072.)，却存在反应效率普遍较低，且只能环化较短的rna，以及有潜在的生物安全风险的问题。连接酶法是通过使用t4 dna连接酶、t4 rna连接酶1或t4 rna连接酶2，催化rna的5’末端单磷酸基团和3’末端羟基反应连接，通常会使用一段与两末端互补配对的dna夹板序列以帮助末端靠近增加环化效率(petkovic,s.；müller,s.rna circularization strategies in vivo and invitro.nucleic acids res.2015,43,2454-2465)。核酶法则主要是利用第一类内含子以及第二类内含子具有自我剪接的机制，通过将内含子拆分成5’和3’两部分，将内含子的5’部分设计在外显子的末端，内含子的3’部分设计在外显子的前端，从而在内含子进行剪接后形成闭合环状的rna，这种方法又称为排列的内含子-外显子(pie)方法(puttaraju,m.；been,m.d.group ipermuted intron-exon(pie)sequences self-splice to producecircular exons.nucleic acid res.1992,20,5357-5364.)(synthesis of circular rnain bacteria and yeast using rna cyclase ribozymes derived from a group iintron of phage t4)。核酶法相较于其他两种环化方法具有明显的优势，该方法不仅反应简单，序列设计过的rna仅需添加镁离子和gtp作为辅助因子，在合适的温度下即可产生circrna；并且，通过对该方法进行改进，在序列中添加了稳定内含子二级结构和促进环化的同源序列，从而在长链rna中也有不错的环化效率，更具有应用前景(wesselhoeft,r.a.；kowalski,p.s.；anderson,d.g.engineering circular rna for potent and stabletranslation in eukaryotic cells.nat.commun.2018,9,2629)。4、但是，目前普遍应用的pie环化rna方法却存在使用的内含子序列选择性少的问题。目前，仅有鱼腥藻属pre-trna-leu基因和t4噬菌体td基因得到了广泛的应用(liu x,zhang y,zhou s,et al.circular rna:an emerging frontier in rna therapeutictargets,rna therapeutics,and mrna vaccines[j].journal of controlled release,2022,348:84-94.)。其中，鱼腥藻属pre-trna-leu的环化效率等均优于t4噬菌体td基因，表明不同内含子序列开发的pie方法性能亦有差异。而本领域尚未开发得到其他内含子序列改造用于pie系统环化rna，且其他内含子序列在环化rna中的功能特性和应用也尚未可知，这些均限制了pie方法的潜力和实际应用。5、因此，本领域期待开发新的、更高效可用于pie方法环化rna的序列，对于拓展rna环化的方法和提高环形rna药物开发效率具有重要的意义。技术实现思路1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一类新型环状rna环化元件，即新型高效构建环状rna的ⅰ型内含子，本发明发现的新型的内含子元件可极大扩展环化内含子的选择，有效解决了目前可供选择的环化内含子种类极少的问题，在环形rna基础研究和药物开发中有广泛的应用前景；2、本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种高效构建环状rna的质粒、试剂盒产品；3、本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种新型一步法构建环状rna的方法，本发明所述一步法高效构建环形rna的方法，极大的简化了环形rna工艺开发流程，有效解决了目前环形rna生产工艺中需要普遍需要两步法的繁琐工艺问题，在未来核酸药物领域具有潜在的应用价值。4、为解决上述技术问题，本发明所述的一种新型环状rna环化元件，所述环化元件包括ⅰ型内含子，所述i型内含子序列从中间拆分，拆分点一侧形成5’内含子ei，另一侧形成3’内含子ie；5、在所述ⅰ型内含子序列上，所述拆分点位于所述ⅰ型内含子的p6a和与其配对的p6a’区域间的loop区域。6、具体的，所述新型环状rna环化元件，所述ⅰ型内含子包括如下表所示序列结构中的至少一种；其中，7、所述ⅰ型内含子以及拆分形成的所述5’内含子、3’内含子的序列结构如下表1所示：8、表1 ⅰ型内含子序列9、10、11、本发明还公开了一种新型环状rna环化质粒，所述载体包含所述新型环状rna环化元件。12、具体的，所述新型环状rna环化质粒，所述质粒从5’到3’包含以下可操作地连接的元件：13、(1)3’内含子ie片段；14、(2)外显子片段e2；15、(3)目标序列；16、(4)外显子片段e1；17、(5)5’内含子ei片段。18、具体的，所述新型环状rna环化质粒，所述质粒还包括转录启动子；19、优选的，所述转录启动子包括t7启动子。20、本发明还公开了一种新型环状rna环化的试剂盒，包括所述构建环状rna的质粒，以及能够将所述质粒线性化的酶、引物，以及gtp、mg2+。21、本发明还公开了一种线性rna，由所述质粒经体外线性转录得到。22、本发明还公开了一种环状rna，由所述质粒经体外线性转录及环化反应得到。23、本发明还公开了一种共转录环化体系，包括以下成分：24、(1)正常体外转录反应所需的各组分；25、(2)除(1)中存在的各组分外，额外添加的终浓度从2mm至5mm的gtp；26、(3)除(1)中存在的各组分外，额外添加的终浓度从10mm至20mm的mg2+；27、(4)所述环化质粒。28、本发明还公开了一种构建环化rna的方法，包括如下步骤：29、(1)构建得到所述环化质粒；30、(2)将所述环化质粒按照所述共转录环化体系进行共转录环化，得到环形rna。31、具体的，所述构建环化rna的方法，所述共转录环化反应包括在37℃反应2-4h的步骤，以及，在55℃反应0.25-0.5h的步骤。32、本发明还公开了一种共转录环化体系，包括以下成分：33、(1)正常体外转录反应所需的各组分；34、(2)额外的h2o，使转录体系放大5-10倍；35、(3)除(1)中存在的各组分外，额外添加的终浓度从2mm至5mm的gtp；36、(4)除(1)中存在的各组分外，额外添加的终浓度从10mm至20mm的mg2+；37、(5)所述环化质粒。38、本发明还公开了一种构建环化rna的方法，包括如下步骤：39、(1)构建得到所述质粒；40、(2)将所述环化质粒按照所述共转录环化体系进行正常体外转录；41、(3)将上述产物进行共转录环化，得到环形rna。42、具体的，所述构建环化rna的方法，所述转录反应包括在37℃反应2-4h的步骤，以及，在55℃进行反应0.25-0.5h的步骤。43、本发明所述新型环状rna环化元件即新型ⅰ型内含子序列，通过对可能用于pie方法的内含子序列进行了拆分改造，进而构建环化rna，并进行了环化剪接活性的筛选，获得了一批新的可用于pie方法环化rna的ⅰ型内含子序列，并发现了新的优异特性，拓展了rna环化的方法和环化催化序列的选择。44、本发明所述构建环状rna的方法，通过构建新的环状rna环化元件即ⅰ型内含子序列，并通过转录条件及体系的优化，不仅实现了高效率的共转录环化，且仅通过转录步骤一步法获得了环化的rna，简化了circrna的生产步骤，有效解决了针对传统pie方法在rna转录后仍需要额外的纯化和环化步骤才能产生circrna，导致工艺操作复杂的问题。45、本发明所述构建环状rna的方法，同样通过构建部分新的环状rna环化元件即ⅰ型内含子序列，并通过转录条件及体系的优化，在常规转录环化方法的基础上，实现了高效率的共转录环化，本发明发现的新型的内含子元件可极大扩展环化内含子的选择，有效解决了目前可供选择的环化内含子种类极少的问题，在环形rna基础研究和药物开发中有广泛的应用前景。当前第1页12当前第1页12