一种酶活性提高的芒果几丁质酶突变体Chitinase及其应用

：本发明属于生物，具体涉及一种酶活性提高的几丁质酶突变体chitinasek172a,k173a及其应用。

背景技术

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背景技术：

1、几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。几丁质酶降解几丁质得到的中间产物被广泛应用于医药、食品加工、化妆品、饲料和造纸等行业，尤其是在农作物病虫害的生物防治中有显著的效果。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的第一个目的是提供几丁质酶的突变体chitinasek172a,k173a，其氨基酸序列如seq id no.3所示。

2、本发明的第二个目的是提供编码上述突变体chitinasek172a,k173a的基因。

3、本发明的第三个目的是提供一种含有编码突变体chitinasek172a,k173a的基因的重组表达质粒。

4、优选，所述的表达质粒是表达载体pmal-c2x。

5、本发明的第四个目的是提供一种含有上述重组表达质粒的宿主表达细胞。所述的宿主表达细胞是大肠杆菌。

6、本发明的第五个目的是突变体chitinasek172a,k173a在催化几丁质水解反应中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供一种获得突变体chitinasek172a,k173a的编码基因的方法，其包括以下步骤：

8、(1)以chitinase(xp_044463598.1)基因为模板，以seq id no.4和seq id no.5所示序列为引物进行pcr，得第一pcr产物，所述的chitinase(xp_044463598.1)基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；

9、(2)以chitinase(xp_044463598.1)基因为模板，以seq id no.6和seq id no.7所示序列为引物进行pcr，得第二pcr产物，所述的chitinase(xp_044463598.1)基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；

10、(3)以第一和第二pcr产物(1:1)为模板，以seq id no.4和seq id no.7所示序列为引物进行pcr，得含酶切位点的突变体chitinasek172a,k173a的编码基因。本发明对所述pcr的体系并没有特殊限定，利用本领域的常规pcr体系即可。

11、目前对于几丁质酶通过定点突变提高酶催化活力尚未有相关报道，本发明通过定点突变将第172位和173位的赖氨酸(lys)突变成丙氨酸(ala)，获得几丁质酶的突变体chitinasek172a,k173a，通过原核表达和蛋白纯化得到几丁质酶及其突变体chitinasek172a,k173a蛋白，通过酶活检测发现，突变体chitinasek172a,k173a酶活性明显提高。本发明可以为生物化学及分子生物学方面针对几丁质酶的进一步研究提供技术参考。

技术特征：

1.芒果几丁质酶的突变体chitinasek172a,k173a，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.3所示。

2.一种编码权利要求1所述的突变体chitinasek172a,k173a的基因。

3.一种含有权利要求2所述的编码突变体chitinasek172a,k173a的基因的重组表达质粒。

4.根据权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于，所述的表达质粒是表达载体pmal-c2x。

5.一种含有权利要求3或4所述的重组表达质粒的宿主表达细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主表达细胞，其特征在于，所述的宿主表达细胞是大肠杆菌。

7.权利要求1所述的突变体chitinasek172a,k173a在催化几丁质水解中的应用。

8.一种获得突变体chitinasek172a,k173a的编码基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)的pcr的程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s、60℃退火20s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

技术总结
本发明公开了一种酶活提高的几丁质酶突变体Chitinase及其应用。几丁质酶的突变体chitinase<supgt;K172A,K173A</supgt;，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述突变体chitinase<supgt;K172A,K173A</supgt;是对序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行定点突变，将第172和173位的Lys突变成Ala，从而提高几丁质酶的活性。本发明所得到的几丁质酶突变体chitinase<supgt;K172A,K173A</supgt;可以作为一种可以显著提高酶催化活力的突变体材料，为几丁质酶的进一步研究提供参考。

技术研发人员：曾睛,杨新泉,段学武,段晓妍,李婷,彭杰椿,刘梦婷
受保护的技术使用者：中国科学院华南植物园
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11